一种二联手足口病灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了两种手足口病病毒株以及由该两种病毒株制备的二联手足口病灭活疫苗。将保藏编号为CGMCC No.7753的人肠道71型病毒株CC-09和保藏编号为CGMCC No.7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16病毒分别接种于扩大传代培养的Vero细胞中培养；分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液；两种病毒原液除菌，混合，吸附佐剂，制备得到二联手足口病灭活疫苗。本发明专利技术所述二联手足口病灭活疫苗免疫原性强，且两种病毒间无交叉抑制作用，可有效预防目前国内流行的手足口病。本发明专利技术所述二联手足口病灭活疫苗制备工艺简单，生产成本低，适合疫苗的规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种疫苗及其制备方法。
技术介绍
手足口病（HandfootandmouthdiseaseHFMD)是一种儿童传染病，又名发瘆性 水疱性口腔炎。多发生于5岁以下儿童，可引起手、足、口腔等部位的疱瘆，该病以手、足和 口腔粘膜疱瘆或破溃后形成溃疡为主要临床症状。少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性 脑膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导还会导致死亡。 手足口病是由肠道病毒引起的传染病，肠道病毒传染性强，传播途径广泛，流行范 围广，传播快，其疾病的流行在一年四季均可出现，且有周期性流行的特点。人是肠道病毒 唯一的自然宿主，主要传染源为患病者、病毒携带者及隐性感染者。引发手足口病的肠道病 毒有20多种（型），其中以A组的柯萨奇病毒A组16型（Coxsachievirus，CA16)和肠道病 毒71型（Enterovirus71，EV71)最为常见。1972~1973年、1986年和1999年澳大利亚均 发生过EV71流行，重症病人大多伴有中枢神经系统症状（CNS)，一些病人还有严重的呼吸 系统症状。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以CNS为主要临床特征的EV71 流行，仅保加利亚就超过750例发病，149人致瘫，44人死亡。日本是手足口病发病较多的国 家，历史上有过多次大规模流行，1969~1970年的流行以CA16感染为主，1973和1978年 的2次流行均为EV71引起，主要临床症状为手足口病，病情一般较温和，但同时也观察到伴 无菌性脑膜炎的病例。1997~2000年手足口病在日本再度流行，EV71、CoxA16均有分离， EV71毒株的基因型也与以往不同。20世纪90年代后期，EV71开始肆虐东亚地区。1997年 马来西亚发生了主要由EV71引起的手足口病流行，4~8月共有2628例发病，仅4~6月 就有29例病人死亡。死者平均年龄1. 5岁，病程仅2天，100%发热，62%手足皮瘆，66% 口 腔溃疡，28 %病症发展迅速，17 %肢软瘫，17例胸片显示肺水肿。 我国自1981年在上海始见手足口病，以后北京、河北、天津、福建、吉林、山东、安 徽、广东等省市均有报道。2008年安徽阜阳、山东菏泽、河南多地集中暴发流行手足口病， 并造成多例患儿死亡。自2008年5月2日起，手足口病被国家纳入丙类传染病管理。近 年来我国手足口病发病率及死亡率呈逐渐上升趋势，据卫生部统计：2011年全国共报告发 病人数是，1619706例，死亡病例509例，2012年全国共报告发病数2198442例，死亡数569 例。EV71和CoxA16引起的手足口病存在隐性感染和轻症病例多，传染源难以发现和控制， 儿童普遍易感，传播途径多，难以有效阻断等特征，且目前手足口病大都仅是依靠常用阿昔 洛韦、伐昔洛韦、泛昔洛韦等高效广谱的抗病毒药物来缩短发热及皮损愈合时间、减轻口腔 疱瘆疼痛，至今还没有针对预防该病的特异性治疗药物。因此研制手足口病疫苗对预防手 足口病的发生具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供两种手足口病病毒株以及由该两种病毒株制备的二联手足 口病灭活疫苗，所述二联手足口病灭活疫苗预防手足口病，预防免疫效果佳，安全性好。 本专利技术提供的一种人肠道71型病毒株CC-09,保藏在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 7753。 本专利技术提供的另一种柯萨奇A16型病毒株CC-16,保藏在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 7752。 本专利技术通过颅腔注射所述人肠道71型病毒株CC-09病毒和柯萨奇A16型病毒株 CC-16病毒的方法对1日龄ICR乳鼠进行攻毒，结果显示3天即可发现小鼠出现精神状态 不佳，行动迟缓、嗜睡等临床症状，4天个别小鼠出现四肢瘫痪的典型手足口临床症状，随后 其他小鼠也都表现出四肢瘫痪的症状，6天时开始出现死亡，第7天小鼠无存活，而对照组 小鼠无临床症状表现。表明本专利技术所述人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株 CC-16两株病毒为强毒株。 本专利技术还提供由上述两种手足口病病毒株制备的手足口病疫苗。 所述的手足口病疫苗，作为优选，为二联灭活疫苗。 本专利技术还提供一种二联手足口病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤： 步骤1:将保藏编号为CGMCCNo. 7753的人肠道71型病毒株CC-09和保藏编号为 CGMCCNo. 7752的柯萨奇A16型病毒株CC-16分别接种于扩大传代培养的Vero细胞或人胚 肺二倍体细胞中培养； 步骤2:分别收获两种病毒培养液，除杂质后浓缩、灭活、纯化得到两种病毒原液； 步骤3:取步骤2制备的两种病毒原液除菌，混合即得所述二联手足口病灭活疫 苗。 作为优选，步骤1所述培养为33°C~36°C培养72~120小时。 作为优选，步骤2所述灭活为用甲醛溶液或丙内酯溶液灭活。 作为优选，步骤2所述纯化为阴离子交换层析、分子筛凝胶过滤层析、复合模式介 质层析中的一种或多种。 进一步的，步骤2所述纯化为先采用阴离子交换层析再采用分子筛凝胶过滤层 析。 作为优选，步骤3所述除菌为经0. 2ym滤膜除菌。 作为优选，步骤3所述混合为将除菌后的两种病毒原液混合后吸附佐剂；或者为 将除菌后的两种病毒原液分别吸附佐剂然后再混合。其中，所述佐剂优选为氢氧化铝溶液。 本专利技术通过小鼠体内效力试验证明本专利技术所述二联手足口病灭活疫苗针对两种 病毒产生了较高的抗体效价，免疫原性强，且两种病毒间无交叉抑制作用。 本专利技术所述由人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16混合制成 的二联手足口病灭活疫苗，针对两种病毒产生了较高的抗体效价，免疫原性强，且两种病毒 间无交叉抑制作用，并对不同地区病毒有广泛的中和保护作用。可有效预防目前国内流行 的手足口病。本专利技术所述二联手足口病灭活疫苗其制备工艺简单，有效地去除了宿主蛋白 和DNA，病毒纯度高，疫苗安全性好，生产成本低，适合疫苗的规模化生产，具有良好的应用 前景。 生物保藏信息： 病毒株CC-09:分类命名：肠道病毒71型，于2013年6月13日保藏在中国微生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研宄所，保藏编号为CGMCCNo. 7753。 病毒株CC-16:分类命名：柯萨奇A16型病毒，于2013年6月13日保藏在中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研宄所，保藏编号为CGMCCNo. 7752。【具体实施方式】： 本专利技术公开了人肠道71型病毒株CC-09和柯萨奇A16型病毒株CC-16及用所述 两种病毒株制备的二联手足口病灭活疫苗及其制备方法。特别需要指出的是，所有类似的 替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。本专利技术的 产品、方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
技术实现思路
、精神和 范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术技术。 针对当前国内手足口病的流行趋势，为更好的预防手足口病的爆发，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人肠道71型病毒株CC‑09，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7753。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于晓方，张文艳，李景良，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：吉林;22