重组人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白制造技术

本发明专利技术公开了一种重组人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白，所述融合蛋白从N端到C端依次含有蛋白(X)、接头肽(L)和乙肝病毒核心蛋白(HBc)，所述接头肽(L)的氨基酸序列为：Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，式中所述n是2～20的整数，所述接头肽(L)的C端连接于HBc的N端，所述蛋白(X)的C端连接于接头肽的N端。其中n等于9或18，所述蛋白(X)为红色荧光蛋白或水泡口炎病毒G糖蛋白。连接HBc与功能蛋白，能达到同时保持接头两端蛋白的功能的目的，解决了目前还没有功能蛋白与HBc融合后还能同时保持两种蛋白的功能的难题，对于HBV的研究有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种融合蛋白，具体涉及一种重组人乙型肝炎 病毒核心蛋白融合蛋白。
技术介绍
融合蛋白是指利用基因工程技术，将两种或两种以上在自然状态下互相分离的蛋 白质融合到一起，被融合的各个部分都处在同一条氨基酸链上，作为一个整体进行表达。融 合蛋白在生命科学相关研究领域及生物产业均有广泛用途。 将两种蛋白质融合表达，通常的方法是将编码这两种蛋白的DNA序列按顺序连接 在一起，形成一个融合的DNA分子，将该DNA分子转入细胞后，在真核启动子的驱动下，即可 转录出相应的mRNA，继而以这些mRNA为模板，利用细胞的翻译机器产生融合蛋白。 构建融合蛋白时，非常重要的一个问题是要保持被融合各部分的功能。如果两种 蛋白仅仅是在一级序列（氨基酸）水平的物理融合，而融合后的蛋白不能还原被融合的两 部分的功能，那么这种融合蛋白的价值将非常有限。为了保持被融合部分的各自功能，首 先需要保持融合部分的各自正常结构，因为结构是功能的基础。为了使两部分各自形成正 确结构，可以采用一些方式将这两部分进行适当分隔，以尽量减少两部分间的相互干扰，通 常，这些方式是利用一些氨基酸接头置于要融合的两部分之间，以达到分隔效果。作为接头 的氨基酸一般是柔性和不带电荷的亲水性氨基酸，常用的是甘氨酸（Gly)和丝氨酸（Ser)， 由这两种氨基酸按一定顺序排列，并重复不同次数，即可形成各种接头，这些接头的长度通 常从6-45个氨基酸不等。然而，采用这些形式和长度的接头在某些情况下并不能达到保持 融合蛋白各部分功能的目的。 乙型肝炎（乙肝）病毒核心蛋白（Hepatitis B virus core protein，HBc)是乙 肝病毒的一种结构蛋白，它是病毒核心颗粒的基本组成单位，一个病毒核心颗粒通常由240 个核心蛋白组成。核心颗粒是乙肝病毒复制的场所，在无核心颗粒或者核心颗粒不完整时， 病毒DNA的复制将无法进行，因此，HBc也是乙肝病毒复制所必需的，判断HBc的功能是否 正常，最重要的是看其表达能否支持病毒DNA的复制。 绿色荧光蛋白（GFP)和红色荧光蛋白（RFP)是常用的标记蛋白，因能在被特定波 长的激发光激发时分别发出绿色和红色荧光，故常用来与其他蛋白质融合，以方便观测其 他蛋白质的生物学行为。GFP或RFP的功能是否正常，主要在于其是否能在被激发时发出绿 色或红色突光。 Weigand等人（J Gen Virol, 2009)曾将GFP融合到HBc上，结果发现该融合蛋白 能保持GFP的正常功能（发绿色荧光），但不能保持HBc的正常功能，即不能形成核心颗粒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种重组人乙型肝炎病毒核心蛋白 融合蛋白。 本专利技术的第一方面提供了一种重组人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白，所述融合 蛋白从N端到C端依次含有蛋白（X)、接头肽（L)和乙肝病毒核心蛋白（HBc)，所述接头肽 (L)的氨基酸序列为： Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，式中所述n 是 2 ~20 的整数，所述接头肽（L) 的C端连接于HBc的N端，所述蛋白⑴的C端连接于接头肽的N端。 在另一优选例中，所述接头肽（L)的氨基酸序列为 Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n，其中 n 等于 9 或 18。 在另一优选例中，所述蛋白（X)为红色荧光蛋白或水泡口炎病毒G糖蛋白。 在另一优选例中，当蛋白（X)为红色荧光蛋白时，n等于9或18 ;当蛋白（X)为水 泡口炎病毒G糖蛋白时，n等于18。 在另一优选例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No: 1、2或3所示。 本专利技术的第二方面提供了一种分离的核酸序列，所述核酸序列为本专利技术第一方面 所述接头肽（U的核酸序列，所述核酸序列如SEQ ID No:4或5所示。 本专利技术的第三方面提供了一种编码本专利技术第一方面所述所述融合蛋白的核酸序 列，所述核酸序列含有本专利技术第二方面所述的接头肽（L)的核酸序列。 本专利技术的第四方面提供了 一种表达载体，所述表达载体含有本专利技术第三方面所述 的核酸序列。 本专利技术的第五方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞被本专利技术第四方面所述的 表达载体转染。 本专利技术融合蛋白可通过将红色荧光蛋白基因或水泡口炎病毒G糖蛋白、HBc基因 以及连接二者的接头肽核酸通过基因重组、转染宿主细胞表达获得。 本专利技术的有益效果是：本专利技术通过构建含有4X甘氨酸-IX丝氨酸（G4S)的多个 氨基酸的长接头，将融合位点设置在HBc的N端，连接HBc与功能蛋白，能达到同时保持接 头两端蛋白的功能的目的，解决了目前还没有功能蛋白与HBc融合后还能同时保持两种蛋 白的功能的难题，对于HBV的研究有重要意义。本专利技术构建的融合蛋白可应用于病毒颗粒 示踪、可作为疫苗载体等。本专利技术设计的多氨基酸连接肽还可以应用在其它功能蛋白与HBc 的融合上，用于构建药物筛选模型等方面，应用前景广阔。【附图说明】 图1是质粒pCH9/3091、HBVl. lc-及HBc的结构示意图。 图2是HBV1. lc-及HBc的功能鉴定Southern blot检测结果图。 图3是不同长度G4S接头对HBc功能影响的Southern blot检测。 图4是不同长度G4S接头GFP-HBc中绿色荧光蛋白表达检测图。 图5是不同长度G4S接头GFP-HBc的Western blot蛋白检测结果图。 图6是核心颗粒颗粒检测结果图；其中，1 :GFP-47G4S-HBc+HBVl. lc-，2 : GFP-92G4S-HBc+HBVl. lc-，3 :GFP-186G4S-HBc+HBVl. lc-。 图7是HBV复制中间体Southern blot检测结果图。 图8是三种融合RFP-HBc中红色荧光蛋白检测结果图。 图9是三种融合RFP-HBc中HBV复制中间体Southern blot检测结果图。 图 10 是 VSVG-92G4S-HBc 及 VSVG-186G4S-HBc 中 HBV 复制中间体 Southern blot 检测结果图。【具体实施方式】 本专利技术实施例中所用试剂来源如下： 质粒pCH9/3091 :德国弗莱堡大学Michael Nassal赠送质粒 pEGFP-Nl :Clonetech 公司，美国 PrimeSTAR HS 高保真聚合酶、5XPrimeSTAR HS buffer、dNTP、2XPrimeSTAR HS premix :Takara 公司，日本 胶回收试剂盒：QIAGEN公司，德国 DpnI、大肠杆菌JM109感受态细胞：Promega公司，美国 HEK293细胞：美国模式菌种收集中心（ATCC) 抗HBc多克隆抗体：DAK0公司，丹麦 抗GFP多克隆抗体：0rigene公司，美国 PCR产物纯化试剂盒：Roche公司，德国 BsmB I、Tango buffer、DTT :Thermo scientific 公司，美国 T71igase :Enzymatics 公司，美国 ATP :New England Biolabs 公司，美国 实施例一、HBV1. lc-及HBc表达载体构建 HBV DNA的成功复制需本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人乙型肝炎病毒核心蛋白融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白从N端到C端依次含有蛋白(X)、接头肽(L)和乙肝病毒核心蛋白(HBc)，所述接头肽(L)的氨基酸序列为：Gly‑Ser‑(Gly‑Gly‑Gly‑Gly‑Ser)n，式中所述n是2～20的整数，所述接头肽(L)的C端连接于HBc的N端，所述蛋白(X)的C端连接于接头肽的N端。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡接力，黄爱龙，陈江燕，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85