本发明专利技术公开了基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，采用紫外和氯化联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中，将水样分别进行紫外光照15s、30s；光照后立即加入NaClO使游离氯分别达到5、20、40mg/L，搅拌，反应120min后加入Na2S2O3以终止反应；取水样用膜过滤；将富集微生物的膜剪碎，提取DNA；定量PCR，检测抗生素抗性基因ARGs的含量。本方法采用UV及氯化联合技术可以产生协同作用，在常规的UV、氯化消毒剂量下较为有效的增加对目标基因的去除率，氯化剂量越小时，协同作用越大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及环境保护的水处理领域，特别是涉及一种消毒技术对污水中抗生素抗 性基因的净化方法。
技术介绍
抗生素抗性基因（Antibtiotics Resistance Genes，ARGs)是一种新型污染物，城 市污水处理厂作为ARGs的重要储存场所，其出水也是ARGs排入水环境中的重要污染源，控 制污水处理厂出水中ARGs对减少环境中ARGs污染，降低ARGs的生态风险具有重要意义。 消毒技术是处理城市污水中病原微生物，保证污水安全排放及回用的重要工艺 段，常用的消毒工艺有氯消毒、UV、臭氧消毒。现有关于污水厂中氯化、UV消毒对ARGs的去 除影响的报道多集中于对污水处理厂水样进行直接的监测，相关的氯化、UV剂量等操作参 数并不明确。
技术实现思路
本专利技术为了解决去除污水中的抗生素抗性基因的问题，提供了一种基于消毒技术 去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体考察了 UV、氯化联合消毒工艺对污水中ARGs去除 的影响。 解决上述技术问题的技术方案如下： ，其特征在于，采用紫外和氯化 联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下： (1)水样预处理 采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中； ⑵消毒 在室温下，将上述步骤（1)采集的水样分别进行紫外光照15s、3〇S，则UV剂量分别 为62mJ/cm 2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaCIO使游离氯分别达到5、20、40mg/L，使用搅拌 器搅拌，反应120min后加入1. 5%的Na2S203以终止反应； ⑶膜过滤 取200mL上述步骤（2)的水样，用0. 22 ym混合纤维滤膜过滤；过滤后保留滤膜并 置于50%乙醇中于-20°C保存以待后续的DNA提取以及随之的基因定量； ⑷DNA提取 将富集微生物的膜剪碎，提取DNA ; (5)定量 PCR 使用实时定量聚合酶链式反应PCR法对四环素类抗性基因tetX、tetG、磺胺类抗 性基因sul、l型整合子编码基因intll及16S rDNA作出定量，所述的定量步骤包括：a)配 制PCR反应体系溶液；b)使用PCR扩增仪进行扩增；c)PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳；d) 测定PCR产物浓度； (6)检测抗生素抗性基因ARGs的含量并分析结果。 优选地，所述的紫外消毒采用有机玻璃制成的圆柱形光化学反应器，圆柱形光化 学反应器中间竖直放置石英套管，石英套管内放置紫外灯，石英套管外壁254nm处的紫外 光强为9. 85mW/cm2,紫外线有效剂量为4. 159mW/cm2。 优选地，所述的NaCIO的有效氯彡8%。 优选地，所述的DNA提取具体步骤如下： a)将滤膜在室温下解冻并剪碎加入裂解管E管中； b)向上述管中加入978 y L磷酸钠缓冲液，及122 y L MT Buffer ; c)将E管放在FastPr印中以速度为6. Om/s振荡40s。随后将E管放置在离心机 中以 14000 X g 离心 lOmin; d)离心后，将上清液转移新的2mL离心管中，加入250 y L蛋白沉淀溶液，手摇10 次离心管混合溶液； e)将离心管放入离心机以14000Xg离心5min，将上清液转移至15mL离心管，并 加入lmL DNA结合溶液，促进DNA与硅胶结合，将离心管上下颠倒2min，随后将离心管放至 在架子上静置3min; f)小心去除500 y L的上清液，重新悬浮剩余的混合液；转移约600 y L的混合液 到含SPIN?Filter的管中，以14000Xg离心lmin;接着将SPIN?Filter管中的液体倒掉； 重复上述过程直到剩余混合液全部转移离心完； g)加入500 y L SEWS-M，溶解和清洗DNA至SPIN?Filter管中，用移液枪吹打使沉 淀物重新悬浮后以14000Xg离心lmin ;将SPIN?Filter管中的液体倒掉，再以14000Xg 离心2min，去除基质中的SEWS-M; h)将SPIN?Filter放到新的Catch Tube中，于室温下风干5min后加入80yL DES，用移液枪枪头在滤膜上轻轻搅动，使滤膜上的沉淀物重新悬浮后以14000Xg离心 lmin，DNA 则转移至 Catch Tube 中； i)将提取的DNA于-20°C或在4°C保存，用于接下来的PCR扩增及其他步骤。 优选地，所述的PCR反应体系溶液为25yL，包括：2. 5yL 10XPCR缓冲液，2yL 皿8(：12,2 1^(1阶13混合剂，上下引物各0.2 1^，0.125 1^￡叉丁39〇嫩聚合酶，2 1^0嫩模 板，即提取的DNA稀释至约20ng/ y L，及ddH20使体系至25 y L。 优选地，使用PCR扩增仪进行扩增，反应温度程序为94°C变性5min后进入35个循 环，每个循环中，先在94°C反应45s，随之在退火温度下反应45s，之后在72°C下反应90s，循 环反应之后再于72°C下反应lOmin，实验中ARGs的扩增效率在90%~100%之间，标曲相 关系数R 2均大于0.99。 优选地，PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳，以观测是否有目标ARGs的扩增产物，对 于含有目标ARGs的PCR产物进行纯化，后进行质粒制备。 优选地，琼脂糖凝胶电泳的具体步骤为： 称取0.3g琼脂糖于锥形瓶中，加入1XTAE 30mL，加热炉加热琼脂糖，加热均匀后 待溶液冷却至30°C左右时向溶液中加入2 y L溴化乙锭，随后将溶液倒入胶床内，插入梳 子，放置60min左右待凝胶固化。将凝胶放入电泳槽中，加入1 X TAE溶液，使溶液没过凝胶 l-2mm。将1 y L Loading Buffer与5 y L的PCR产物混合均匀，加入凝胶中上样孔中。盖 上泳槽，接通电源，在100V电泳25min，电泳结束后，取出凝胶在凝胶成像仪上观测结果。 优选地，PCR产物纯化具体步骤为： a)在PCR产物溶液中，加入3倍产物体积Buffer PCR-A，混匀后转移至PCR制备 管，将PCR制备管置于提供好的2mL离心管中，以12000Xg离心lmin，并弃掉滤液； b)将 PCR 制备管置回 2mL 离心管，加 700 yL Buffer W2,以 12000Xg 离心 lmin， 弃滤液。随后加入400 yL Buffer W2,以12000Xg离心lmin; c)将制备管置于1. 5mL洁净离心管，在制备管膜中央加25-30 yLEluent或去离 子水，室温静置lmin，随后以12000Xg离心lmin洗脱DNA。 优选地，使用超微量紫外分光光度计测定PCR产物浓度，计算其摩尔数：【主权项】1. ，其特征在于，采用紫外和氯化联 合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下： (1) 水样预处理 采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中； (2) 消毒 在室温下，将上述步骤（1)采集的水样分别进行紫外光照15s、30s，相应的UV剂量分别 为62mJ/cm2、125mJ/cm2;光照后立即加入NaCIO使游离氯分别达到5mg/L、20mg/L、40mg/L， 使用搅拌器搅拌，反应120min后加入1. 5%的Na2S203以终止反应； (3) 膜过本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于消毒技术去除污水中抗生素抗性基因的方法，其特征在于，采用紫外和氯化联合工艺，达到去除污水中抗生素抗性基因的方法，具体的步骤如下：(1)水样预处理采集含有抗生素抗性基因的污水至灭菌容器中；(2)消毒在室温下，将上述步骤(1)采集的水样分别进行紫外光照15s、30s，相应的UV剂量分别为62mJ/cm2、125mJ/cm2；光照后立即加入NaClO使游离氯分别达到5mg/L、20mg/L、40mg/L，使用搅拌器搅拌，反应120min后加入1.5％的Na2S2O3以终止反应；(3)膜过滤取200mL上述步骤(2)处理的水样，用0.22μm混合纤维滤膜过滤；过滤后保留滤膜并置于50％乙醇中于‑20℃保存以待后续的DNA提取以及随之的基因定量；(4)DNA提取将富集微生物的膜剪碎，提取DNA；(5)定量PCR使用实时定量聚合酶链式反应PCR法对四环素类抗性基因tetX、tetG、磺胺类抗性基因sul、1型整合子编码基因intIl及16S rDNA作出定量，所述的定量步骤包括：a)配制PCR反应体系溶液；b)使用PCR扩增仪进行扩增；c)PCR后产物进行琼脂糖凝胶电泳；d)测定PCR产物浓度；(6)检测抗生素抗性基因ARGs的含量并分析结果。...
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：耿金菊，张滢楹，任洪强，庄耀，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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