本发明专利技术涉及鼠的实时荧光PCR检测方法，使用TaqMan探针实时荧光PCR检测技术，对鼠进行物种成分检测，属于生物技术领域。鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，该方法包括以下的步骤：1）样本DNA提取；2）实时荧光PCR扩增检测；3）结果判定；Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，且所涉及的鼠种皆为我国常见种类，因此本发明专利技术可协助有关部门有效打击肉及肉制品制假贩假的恶劣行径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及鼠的实时荧光PCR检测方法，使用TaqMan探针实时荧光PCR检测技 术，对鼠进行物种成分检测，属于生物
技术介绍
近年来，肉和肉制品的掺杂掺假事件频频被媒体曝光，已经成为中国食品质量控 制面临的重要挑战之一。不法分子将价格相对廉的猪肉、鸡肉、鸭肉冒充牛肉、羊肉销售。近 日有报道称，不法商贩将老鼠肉掺入牛羊肉中进行销售。老鼠作为疫病的传播源，加工食用 对健康风险很大。动物物种成分检测是打击肉制品制假掺假的有效手段，但目前并没有一 种针对鼠成分的高效准确的检测方法。 形态学方法是传统的动物种属鉴定方法，然而受其准确性和重复性较差，已不能 满足对肉制品等一系列动物制品掺假现象的监管与控制的需求。种属鉴定的免疫学方法大 都直接鉴定样本中的蛋白成分，其基本原理是抗体抗原反应，但免疫学方法存在对样本材 料要求高，检测准确率低等缺陷，如动物食品若经过加热、腌制等处理，其蛋白结构一旦遭 到破坏，免疫学方法便不再适用。而分子生物学方法，基于核酸等遗传物质的高稳定性和多 样性等特点，已被广泛应用于物种种属鉴定，特别是以PCR技术为基础的核酸检测方法被 应用到物种鉴别已有20年的历史。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用 荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。
技术实现思路
为了解决上述的技术问题，本专利技术的一个目的是提供一种鼠的实时荧光PCR物种 成分检测方法，本专利技术的第二个目的是提供上述方法的检测引物和探针，本专利技术的第二个 目的是提供上述方法的试剂盒。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，且 所涉及的鼠种皆为我国常见种类，可协助有关部门有效打击肉及肉制品制假贩假的恶劣行 径。 为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： 鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，该方法包括以下的步骤： 1)样本DNA提取； 2)实时荧光PCR扩增检测； 实时荧光PCR反应体系如下：10ul Premix Ex Taq，上游引物0.4ul，下游引物 0. 4ul，探针0. 4ul，上游引物、下游引物和探针浓度均为10pmol/y 1 ;上游引物的序列为 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列为AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探针的序 列为FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的Y*表示兼并碱基C或T ;取上述提取的 DNA液lul，用水补足体积至20ul ;应用荧光定量PCR仪lightcycle 480进行反应，反应程 序为（1) 95°C，lOsec ; (2) 95°C，5sec ;6(TC，23sec ;40个循环； 3)结果判定；Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。 作为优选，所述的样本DNA提取的方法如下：取0. 2g鼠肉，在液氮中充分研磨后， 使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提，抽提后的DNA溶解在100ul水中。 作为优选，所述的DNA抽提试剂盒采用Promega FF3750。 为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： 鼠的实时荧光PCR物种成分检测用引物和探针，上游引物的序列为 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列为 AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探针的序 列为 FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的 Y*表示兼并碱基 C 或 T。 为了实现上述的第三个目的，本专利技术采用了以下的技术方案： 鼠的实时荧光PCR物种成分检测用试剂盒，该试剂盒包括上游引物、下游引物和 探针，所述的上游引物的序列为AAAY #CCAACTTATATGTGAAAATTCATTGT，下游引物的序列为 AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探针的序列为 FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的 Y* 表示 兼并碱基C或T。 本专利技术基于具有高度物种特异性的鼠线粒体12S核糖体RNA(12S ribosomal RNA)序列（基因序列号：KC663621. 1、FQ210435. 1、AJ005780. 1 和 AJ311140. 1)设计 了鼠科（Muridae)鼠亚科（Murinae)内具有小家鼠（Mus musculus)、褐家鼠（Rattus norvegicus)、黑家鼠（Rattus rattus)、黄胸鼠（Rattus flavipectus)、黑线姬鼠 (Apodemus agrarius)等物种特异性的引物和探针，实现以Real-time PCR的方法对上述鼠 种进行物种成分检测。本方法由于其引物和探针具有很高的特异性和灵敏度，且所涉及的 鼠种皆为我国常见种类，因此本专利技术可协助有关部门有效打击肉及肉制品制假贩假的恶劣 行径。【具体实施方式】 实施例1:引物和探针的设计 基于具有高度物种特异性的鼠12S核糖体RNA(12S ribosomal RNA)序列（基因序 列号：KC663621. 1、FQ210435. 1、AJ005780. 1和AJ311140. 1)，用生物信息学方法对上述序 列进行比对，并根据引物设计原则，利用Primer Express设计软件，设计出特异性引物和荧 光探针若干组。将设计得到的引物和探针--进行BLAST验证（http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/)，以保证引物的高特异性。经过上述验证，最后选择了如表1所示的引物和探针， 并在探针上标记了荧光信号，以实现实时荧光检测。 表1鼠的荧光Real-time PCR物种成分检测的引物和探针【主权项】1. 鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤： 1) 样本DNA提取； 2) 实时荧光PCR扩增检测； 实时荧光PCR反应体系如下：10ulPremixExTaq，上游引物0.4ul，下游引物 0. 4ul，探针0. 4ul，上游引物、下游引物和探针浓度均为10pmol/y1 ;上游引物的序列为 AAAY*CCAACTTATATGTGAAAAITCAITGT，下游引物的序列为AGTACCGCCAAGTCCITTGA，探针的序 列为FAM-TACCCCACTATGCTTAGCC-Eclipse，所述的Y*表示兼并碱基C或T;取上述提取的 DNA液Iul，用水补足体积至20ul;应用荧光定量PCR仪Iightcycle480进行反应，反应程 序为（1) 95°C，10sec;(2) 95°C，5sec; 60°C，23sec;40 个循环； 3) 结果判定；Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。2. 根据权利要求1所述的鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，其特征在于样本DNA 提取的方法如下：取〇. 2g鼠肉，在液氮中充分研磨后，使用DNA抽提试剂盒进行DNA抽提， 抽提后的DNA溶解在IOOul水中。3. 根据权利要求2所述的鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，其特征在于DNA抽提 试剂盒采用PromegaFF3750。4. 鼠的实时荧光PC本文档来自技高网...
【技术保护点】
鼠的实时荧光PCR物种成分检测方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）样本DNA提取；2）实时荧光PCR扩增检测；实时荧光PCR反应体系如下：10ul Premix Ex Taq，上游引物 0.4ul，下游引物 0.4ul，探针0.4ul，上游引物、下游引物和探针浓度均为10 pmol/μl；上游引物的序列为AAAY*CCAACTTATATGTGAAAATTCATTGT，下游引物的序列为AGTACCGCCAAGTCCTTTGA，探针的序列为FAM‑TACCCCACTATGCTTAGCC‑Eclipse，所述的Y*表示兼并碱基C或T；取上述提取的DNA液1ul，用水补足体积至20ul；应用荧光定量PCR仪lightcycle 480进行反应，反应程序为(1) 95°C，10 sec；(2) 95°C，5 sec； 60℃，23 sec；40 个循环；3）结果判定；Ct值小于等于35时，结果为阳性，Ct值大于35时为阴性。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴姗，曹新前，虞惠贞，吴昺，
申请(专利权)人：浙江省检验检疫科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。