耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCC No.9976及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。属于微生物技术领域。应用包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养；（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养：将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。本发明专利技术耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21能够在有空气氧条件下将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，转化性能稳定，且方法简单，生产成本低，解决了达维荚蒾苷元难于在有空气氧条件下规模化生产的难题。

【技术实现步骤摘要】
耐氧夏普氏菌及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用
本专利技术涉及微生物

技术介绍
甘草（Licoriceroots）是一味古老的中药材，具有保肝、祛痰止咳、清热解毒、补脾益气、抗菌消炎、抗癌、降糖、免疫调节、神经保护等多种功效，临床上主要用于治疗呼吸系统、消化系统和免疫系统等疾病。甘草中的黄酮和酚类是甘草中的标志性化合物，甘草苷（Liquiritin）是甘草中含量较高的黄酮成分之一，有研究表明，甘草苷在酸性条件下或在人肠道微生物菌群产生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解为甘草素（Liquiritigenin，简称LG）。LG是Akt蛋白激酶抑制剂，也是有较高选择性的雌激素受体激动剂，对肝细胞等具有保护作用。甘草不论是做成中成药还是作为汤药熬服，最终都要经口服进入体内，甘草中的众多药理活性成分具有被寄居在胃肠道的微生物菌群降解为不同代谢产物的可能性。1998年，Li等（BiolPharmBull,1998,12:1251-1257）在人尿液检测到了甘草代谢产物达维荚蒾苷元（Davidigenin，简称DG），而DG在天然甘草提取物中未能检测到，故推测人体肠道微生物菌群可将LG转化为DG。此后，Zuo等的研究结果进一步证实LG可被人肠道微生物菌群代谢为DG（BiolPharmBull,2002,25:558-563）。由于DG资源匮乏，有关其生理活性方面研究报道较少，但从目前已有研究结果看，DG除具有与LG相似的生理功能，如止咳、降糖等外，还表现出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺细胞纤维化，抗过敏和抗痉挛等。随着DG生理功能研究的不断深入，这意味着DG今后极有可能开发为不同于目前甘草药效的其他新药。此外，体外抗氧化试验结果表明，产物达维荚蒾苷元对二苯代苦味酰基自由基（DPPH）的体外清除率极显著高于相同浓度的底物甘草素（药学学报，2012，47(5):664-669）。目前虽在某些植物中，如ViburnumdavidiiFranch，Caprifoliaceae等，有分离得到天然DG的报道，但天然DG在植物细胞中的含量极低，试图从天然植物中大规模化提取DG几乎是不可能的。有关DG的化学合成方法已有报道，但大多是通过在无氧条件下提供昂贵的化学催化剂钯经化学加氢来完成（BiomedChromatogr,1997,11:125-231），所需成本高，且易造成环境污染。专利文献CN102367424B公开了一种红椿菌AUH-Julong21及其在达维荚蒾苷元生物合成中的应用，该红椿菌AUH-Julong21在厌氧条件下可将0.8毫摩尔/升的底物甘草素高效转化为产物达维荚蒾苷元，平均转化率91.3%。然而，细菌菌株AUH-Julong21为严格厌氧菌株，该菌株只能在严格厌氧条件下生长和完成转化过程，这增加了DG的生产成本，不利于DG的规模化生产。文献“牛瘤胃耐氧细菌菌株Aeroto-Niu-O16对中药甘草主要活性成分甘草素的开环转化”中，用耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在有空气氧条件下转化底物甘草素为DG，但能高效转化底物甘草素的最大浓度为0.8毫摩尔/升，且平均转化率仅为71%~78%；当底物甘草素浓度升至1.2毫摩尔/升时，平均转化率仅为53.6%（药学学报，2012，47(5):664-669）。由于耐氧突变株Aeroto-Niu-O16在有氧条件下生长时，会在其菌体外壁形成一层以多糖为主要成分的抗氧化“保护膜”结构（ApplMicrobiolBiot,2011，92(4),803-813），该抗氧化“保护膜”会阻碍底物进入菌体内被转化，也会阻碍产物从菌体内运出。因而，耐氧菌株Aeroto-Niu-O16尽管在耐氧能力上明显增强，但在有空气氧条件下的转化效率仍较低，不利于产物DG的高效规模化生产。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21及其在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。该菌株能够在自然条件下（即有空气氧条件下）将底物甘草素高效转化为达维荚蒾苷元，且转化性能稳定，解决了达维荚蒾苷元在有空气氧条件下难于规模化生产且成本过高的问题，对达维荚蒾苷元新药理活性研究及新药研发具有极大的推动作用。为解决上述技术问题，本专利技术所采取的技术方案是：一种耐氧夏普氏菌（sharpeasp.）Aeroto-AUH-JLD21，保藏号为CGMCCNo.9976。耐氧夏普氏菌sharpeasp.Aeroto-AUH-JLD21是由保藏号为CGMCCNo.5306的严格厌氧红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21（EU919864）经过长期耐氧驯化后得到的、既能在有空气氧条件下生长又能高效转化甘草素为达维荚蒾苷元的耐氧突变株。红椿菌Coriobacteriumsp.AUH-Julong21是从人粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该菌株在厌氧工作站内能将甘草素高效转化为达维荚蒾苷元。本专利技术中的耐氧夏普氏菌sharpeasp.Aeroto-AUH-JLD21菌株（简称耐氧菌株Aeroto-AUH-JLD21）已于2014年11月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号为CGMCCNo.9976。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。耐氧夏普氏菌sharpeasp.Aeroto-AUH-JLD21的分类学特征为：菌落发黄，菌落外围无透明圈；菌体在BHI液体培养基中呈长丝状，交织在一起，生长12小时后大部分菌体沉落在试管底部。该菌株淀粉水解酶活性阳性，吲哚反应阴性，脲酶阴性，可发酵葡萄糖产酸产气，能利用乳糖、甘露糖、蔗糖、水杨苷、纤维二糖和棉籽糖等，不能利用鼠李糖、甘露醇、山梨醇、松叁糖等。经刚果红染色及电镜观察，耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21菌体外壁几乎看不到抗氧化“保护膜”结构。本专利技术还提供了耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用。应用包括下述步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，37℃活化培养24小时；再以10%接种量将上述活化后的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养将上述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。优选的，步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15%接种量转接到发酵培养基中，同时加入母液浓度为40～60毫摩尔/升的底物甘草素，使甘草素在培养基中的终浓度为1.6～2.0毫摩尔/升，在37℃恒温培养箱内培养2～3天；发酵培养基为添加5.93克/升NaH2PO4和22.21克/升Na2HPO4的BHI液体培养基，pH值为7.0～7.3，为方便描述，将其记为发酵培养基A。耐氧夏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种耐氧夏普氏菌（sharpea sp.）Aeroto‑AUH‑JLD21，保藏号为CGMCC No.9976。

【技术特征摘要】
1.一种耐氧夏普氏菌（sharpeasp.）Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21保藏号为CGMCCNo.9976。2.根据权利要求1所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：（1）耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的培养将低温冷冻保存的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21融化并按10～15%接种量接种到添加0.05%L-半胱氨酸的新鲜BHI液体培养基中，在37℃恒温培养箱内活化培养24小时；再以10%接种量将上述活化后的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21转接到新鲜的BHI液体培养基中，培养4～8小时作为种子液；（2）底物甘草素与耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21共培养将上述耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液转接到发酵培养基中，同时加入甘草素进行共培养；（3）代谢产物达维荚蒾苷元的分离纯化。3.根据权利要求2所述的耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21在达维荚蒾苷元有氧合成中的应用，其特征在于所述步骤（2）中将耐氧夏普氏菌Aeroto-AUH-JLD21的种子液按10～15%接种量转接到发酵培...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀伶，杨露，彭文涛，王铭，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13