本发明专利技术涉及可与人B淋巴细胞表面所表达的膜结合IgE(mIgE)的CεmX结构域有效结合的抗体的产生和应用。提出将位于人膜结合ε链的CH4结构域和C末端膜锚定肽之间的52个氨基酸残基的CεmX结构域作为抗原位点，用于免疫靶向表达mIgE的B细胞。以前所报道的与CεmX的C末端的RADWPGPP(SEQ ID NO:1)肽结合的单克隆抗体，包括a20在内，目前据发现与人B细胞上的mIgE的结合较差。我们发现，只有对CεmX的某些片段具有特异性的单克隆抗体可与人B细胞上的mIgE有效结合，这些片段例如GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)，并因此具有靶向那些B细胞而用于治疗IgE介导的疾病的应用。
【技术实现步骤摘要】
能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗CεmX抗体专利技术背景IgE在介导I型超敏反应中起到决定性作用，I型超敏反应负责导致的过敏性疾病，包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎等。过敏性反应是免疫系统对无害环境物质的应答，所述环境物质例如尘螨、树木和草的花粉、某些食品和药物以及蜜蜂和火蚁叮咬。在这些反应中，过敏原与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面IgE的结合引起IgE交联和相关IgE.Fc受体的聚集，所述IgE.Fc受体为I型IgE.Fc受体或FcεRI。该受体聚集随后激活信号途径，导致颗粒的胞吐和药理介质的释放，所述药理介质例如组胺、白三烯、类胰蛋白酶、细胞因子和趋化因子。那些介质从肥大细胞和嗜碱性粒细胞的释放导致过敏反应的各种病理表现。已经开发出用于治疗IgE介导的过敏性疾病的抗IgE的抗体，该抗体与血液和组织液中的游离的IgE和B细胞上的mIgE结合，但是不与嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI所结合的IgE结合。利用人源化抗IgE抗体即奥马珠单抗(商品名Xolair)的治疗在多种过敏性病症中表现出弱化I型超敏性的多重药理作用。抗体与IgE在Fc的CH3结构域中的位点高亲和力结合，该位点与FcεRI的结合位点重叠。因此，该疗法基于抗体与游离IgE和B淋巴母细胞和记忆B细胞上的mIgE的结合，这导致血液和组织液中总的游离IgE水平下降。抗IgE与游离的IgE的结合进一步阻止IgE与嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面上的FcεRI的结合。由于未被IgE占据的FcεRI不稳定，且随后内化并降解，以抗IgE结合耗尽游离的IgE也逐渐下调嗜碱性粒细胞和肥大细胞上的FcεRI。已经发现了抗体疗法其它作用的证据，包括中和细胞因子活性、弱化总炎性活性和可能通过IgE-抗-IgE免疫复合物的累积清除过敏原。本专利技术的专利技术人之一(T.W.Chang)发现，IgE除了与奥马珠单抗结合的位于CH3上的抗原位点之外，被称为CεmX的另一个抗原位点存在于人mIgE上，用于靶向表达mIgE的B淋巴细胞。CεmX是位于人膜结合ε链(mε)的CH4结构域和C末端膜锚定片段之间的52个氨基酸的片段。在大多数所研究的人个体中，已经证明，没有CεmX的mε(mεS)占有极小的比例，而具有CεmX的mε链(mεL)优势表达。游离、分泌型IgE的ε链的mRNA和mIgE的mεS和mεL的mRNA都来源于εRNA转录本的可选剪接。CεmX的氨基酸和核苷酸序列在整个蛋白和DNA数据库中是唯一的。因此，CεmX为靶向mIgE和表达mIgE的B细胞提供了特有的抗原位点。Chang的研究组以前报道了所开发的数种CεmX特异性小鼠单克隆抗体，包括a20在内，这些抗体能与含有CεmX片段的重组蛋白和SKO-007细胞系的细胞结合，并且能与CHO细胞系的细胞结合，所述SKO-007细胞系是表达人mIgE的人骨髓瘤来源的细胞系，所述CHO细胞系用对应于mεL的CH2结构域至细胞质末端的片段(mεL(CH2-CM)；CM:细胞质)的基因转染。单克隆抗体a20及其所有早期开发的抗体均被发现与位于52a.a.CεmX结构域C末端的8-a.a.肽区域、RADWPGPP(SEQIDNO:1)、残基#45-52结合。专利技术概述本专利技术涉及对人mIgE的CεmX结构域具有特异性并能与人B淋巴细胞上的mIgE结合的抗体的开发和鉴定。本专利技术还涉及这些抗体在治疗由IgE介导的过敏性疾病和其他疾病中的应用。在研究由Chang的研究组开发的抗CεmX单克隆抗体a20的过程中，发现a20与mεL(CH2-CM)基因所转染的细胞系的结合较好，所述细胞系，例如CHO细胞系或NS0细胞系，不表达Igα(CD79a)、Igβ(CD79b)、CD21、CD19、CD81和其他与B细胞受体(BCR)相关的蛋白。然而，发现a20与mεL(CH2-CM)基因所转染的表达Igα、Igβ和其他BCR相关蛋白的细胞系结合不良，例如Ramos细胞系。我们设想，a20所识别的位于CεmX上的抗原表位可能被某些BCR相关蛋白封闭。因此，a20单克隆抗体及其嵌合或人源化版本不适于在体内用于人类患者中，用于靶向表达mIgE的B淋巴母细胞和记忆细胞的目的。如果肽表位RADWPGPP(SEQIDNO:1)是用于诱导抗体应答的唯一表位，那么利用以含人CεmX的蛋白所免疫的小鼠由杂交瘤方法产生的单克隆抗体，对该肽区域都将是特异性的。然而，如果该表位是优势表位，但不是唯一的免疫原性表位，那么仍可开发对CεmX上其他抗原表位具有特异性的单克隆抗体。可能在CεmX上存在不能由BCR相关蛋白封闭的表位，用于抗体结合。如果是这样，还可以开发与B细胞上的IgE结合并且可用于靶向这些B细胞的抗体。在以下的实施例中，我们成功地表明，尽管RADWPGPP(SEQIDNO:1)是优势表位，但是其不是CεmX上唯一的免疫原性和抗原表位。此外，我们发现了单克隆抗体、4B12和26H2，其与不在RADWPGPP(SEQIDNO:1)区域内的抗原表位上的CεmX结合。那些单克隆抗体在结合CεmX中不与a20抗体竞争。它们与B细胞上mIgE的结合比a20更牢固，并且在导致表达mIgE的细胞的抗体依赖性细胞溶解和凋亡中比a20更有效。实施例表明，诸如4B12和26H2的单克隆抗体能与人B淋巴细胞上的mIgE结合，并且适合用于靶向表达mIgE的B淋巴母细胞和记忆B细胞，用于下调IgE合成。嵌合或人源化形式的抗体适于用在受IgE介导的过敏性疾病所影响的患者中，所述过敏性疾病例如过敏性哮喘、过敏性鼻炎和特应性皮炎。由于已证实抗IgE对IgE的中和可有效治疗寒冷诱发的荨麻疹、慢性荨麻疹、胆碱能性荨麻疹、慢性鼻窦炎、系统性肥大细胞增生症、皮肤肥大细胞增生症、过敏性支气管肺曲霉病、复发性先天血管性水肿和间质性膀胱炎或嗜酸性粒细胞相关的胃肠病症，因此也可以利用诸如4B12和26H2的抗体治疗这些各种疾病。实施例还提出4B12和26H2所识别的肽在诱导针对CεmX和因而针对表达mIgE的B细胞的免疫应答中的潜在应用。具有相似的抗原特性即具有与抗CεmX抗体的结合活性的肽及其类似物，例如4B12和26H2，可以单独使用或与分子构建体联合使用，所述分子构建体还含有能诱导T细胞辅助的部分。这类构建体能诱导针对表达mIgE的B细胞的活性免疫，并因此实现下调总IgE合成的作用。实施例实施例1：与RADWPGPP(SEQIDNO:1)之外的抗原位点结合的新的抗CεmX单克隆抗体。为了诱导抗CεmX免疫应答，用50μg溶解的n-十一烷基-β-d-麦芽吡喃糖苷(UDM；Anatrace)mIgE.FcL重组蛋白按照厂商的意见以两周的间隔皮下免疫BALB/c小鼠两次，所述mIgE.FcL重组蛋白在TiterMaxGold佐剂(Sigma-Aldrich)中乳化。我们避免超免疫方案，以便小鼠不会仅产生针对优势RADWPGPP表位的抗体。用0.1mgUDM溶解的mIgE.FcL重组蛋白在没有佐剂的情况下腹膜内进行最后一次加强。融合前一天，将NS0细胞以5×105个细胞/ml的细胞密度重新接种于新鲜的DMEM培养基(Invitrogen)中，所述DMEM培养基补充有10％热灭活的胎牛血清(FBS；In本文档来自技高网...
【技术保护点】
诱导免疫应答的方法，其包括：给予有需要的人个体有效量的选自GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQ ID NO:2)和HSGQQQGLPRAAGGSVPHPR(SEQ ID NO:3)的免疫原以及佐剂。
【技术特征摘要】
2009.02.25 US 61/155,2241.免疫原在制备用于在有需要的人个体中诱导免疫应答的药物中的用途，其中所述免疫原是GLAGGSAQSQRAPDRVL(SEQIDNO:2)。2.如权利要求1所述的用途，其中所述个体患有IgE介导的疾病。3.如权利要求2所述的用途，其中所述IgE介导的疾病是寒冷诱发的荨麻疹，慢性荨麻疹，胆碱能性荨麻疹，慢性鼻窦炎，系统性肥大细胞增生症，皮肤肥大细胞增生症，过敏性支气管肺曲霉病，复发性先天血管性水肿，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张子文，陈君柏，费迪亚斯·C·吴，阿尔弗尔·F·洪，
申请(专利权)人：中央研究院，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71
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