亚硝酸盐含量降低的植物的产生制造技术

本发明专利技术涉及亚硝酸盐含量降低的植物的产生。本发明专利技术一方面涉及产生转基因植物的方法，该方法包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰植物降低了转基因植物的亚硝酸盐含量。本发明专利技术也提供包含编码亚硝酸还原酶的外源基因的转基因植物和植物细胞，以及相关用途、嵌合基因和植物转化载体。

【技术实现步骤摘要】
亚硝酸盐含量降低的植物的产生本申请为申请号为200880110170.8的分案申请，要求2007年8月15日的优先权。专利
本专利技术涉及产生转基因植物的方法。特别是，本专利技术涉及降低植物中亚硝酸盐含量的方法以及通过该方法获得的转基因植物和相关用途。专利技术背景氮同化作用对于植物生长非常重要。在植物需要的所有矿物营养中，氮的需求量最大。植物在田地中吸收氮的主要形式是硝酸盐和氨，它们是氮肥的主要成分。植物从土壤中吸收硝酸盐或铵离子，取决于它们的可获得性。硝酸盐在含氧充足的非酸性土壤中更丰富，而铵在酸性或渍水土壤中占优势。烟草的生长参数试验(1999)明确证实了相对生长速率、叶绿素含量、叶面积和根面积随着硝酸盐供给的增加显著增加。根通过特异转运体的作用吸收硝酸盐和氨(Rothstein等,1998)。植物中存在对硝酸盐具有不同亲和力的不同转运体系。接着硝酸盐或者被胞质酶硝酸还原酶(NR)还原并进入氮同化途径或者被转运至木质部的枝条。硝酸盐从根的表皮细胞和皮层细胞转运至维管系统进一步转运至枝条(Crawford,1995)。它通过质外体进入叶并跨过质膜转运至叶肉细胞。在这里它或者储存在液泡中或者在胞质中被还原并进入初级氮同化途径。当硝酸盐过量时它储存于液泡中。这可作为渗压剂和硝酸盐吸收最少时待用的矿物N的来源(Crawford和Glass,1998)。胞质中存在的硝酸盐是初级氮同化的起点。硝酸盐在胞质溶胶中被胞质酶硝酸还原酶(NR)还原成亚硝酸盐，其自身被叶子叶绿体或非光合器官质体中的亚硝酸还原酶(NiR)快速还原成铵(Crawford,1995,Crete等,1997,Tobin和Bowsher,2005)。在叶绿体中铵接着进入谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶循环(GS/GOGAT)，在那里它掺入氨基酸库。NR被认为是生长和硝酸盐同化的限速因子(Solomonson&Barber,1990,Tischner,2000)并且是氮同化的第一个关键步骤。它催化硝酸盐的2电子还原至亚硝酸盐，使用NAD(P)H作为电子供体(Wray和Kinghorn,1989)。有三种形式的NR；游离NR(活性)、磷酸化NR(活性pNR)和pNR:14-3-3(非活性)。3种类型的比例随外部条件而变化(Kaiser等,2002)。这一复杂的NR调控控制了硝酸盐的还原这样不会在细胞中积累有害量的亚硝酸盐(Lillo等,2003)。Lea等,(2006)证明了烟草植物中NR的翻译后调控对NR活性和相关代谢物水平具有最大作用。采用组成型启动子CaMV(35S)引入NR并因此在转录水平解除对NR的调节对代谢物水平几乎没有影响，因为翻译后调控机制仍然具有活性。然而翻译后调控的丧失会引起嫩烟草叶的褪绿病(Lillo等,2003)。在烟草中，定向突变Ser521至天冬氨酸可防止NR的翻译后磷酸化(Kaiser等,2002,Lillo等,2003,Lea等,2006)。当这一翻译后调控已受到破坏时，NR的组成型活化引起亚硝酸盐积累和褪绿病叶片。NR的第二个功能为还原亚硝酸盐至一氧化氮和一氧化二氮。已知一氧化氮(NO)在植物防御、生长和发育中具有重要的信号传导作用(Wendehenne等,2004)。NO产生只利用1％的NR能力并依赖于亚硝酸盐浓度(Kaiser等,2001,Rockel等,2002)。通过经纯化的玉米NR从亚硝酸盐产生NO可被硝酸盐(50μM)竞争性抑制并且当相对于亚硝酸盐还原更高的硝酸盐还原引起亚硝酸盐水平积累时NO的产生速率增加(Rockel等,2002)。在亚硝酸还原酶(NiR)活性严重降低的转基因烟草中报导了相应的NO释放增加。这也伴随着参与硝酸盐还原调控的14-3-3蛋白质的合成增加(Morot-Gaudry-Talarmain等,2002)，并有可能与控制细胞中亚硝酸盐潜在有害积累的尝试相关。亚硝酸还原酶(NiR)是硝酸盐同化途径中的第二个酶并涉及从被还原的铁氧还蛋白转移六个电子至亚硝酸盐形成铵(WrayandKinghorn,1989)。绿叶中的NiR分子量为63kDa并且是单体(Crété等,1997)。NiR主要存在于C3植物叶子的叶绿体和C4植物叶肉细胞中的叶绿体，以及非绿色组织中的质体(Tobin和Bowsher,2005)。已显示该酶为金属蛋白(Swarmy等,2005)并包含亚硝酸盐结合的西罗血红素(sirohaem)辅基和可能为起始电子受体的4Fe/4S中心。NiR由三个紧密折叠在辅因子周围的结构域、西罗血红素和4Fe/4S簇组成。NiR与其电子供体铁氧还蛋白和底物亚硝酸盐形成复合物，4Fe/4S簇从铁氧还蛋白接受电子并将它们转移至西罗血红素，其接着将电子转移至底物亚硝酸盐，其保持结合直至完全还原至氨(Swamy等,2005)。NiR在细胞核中由NiR基因编码(Dorbe等,1998)，因此该蛋白质必须从胞质转移至叶绿体。菠菜NiR前体蛋白比成熟蛋白长32个氨基酸。这些附加的氨基酸很可能是引导NiR至叶绿体的转运肽序列(Wray和Kinghorn,1989)，在叶绿体中这一肽必须裂解以形成活性蛋白。在多种植物中鉴定了NiR同种型。烟草中有四个NiR基因：NiR1和NiR3主要编码叶特异性NiRs，NiR2和NiR4主要编码根NiRs(Kronenberger等,1993,Stohr和Mack,2001)。在两个烟草祖先种中发现了这些基因的同系物，茸毛烟草(Nicotianatomentosiformis)中的NiRl和NiR2以及林生烟草(Nicotianasylvestris)中的NiR3和NiR4(Kronenberger等,1993)。在拟南芥菜、菠菜和大豆中只有一种NiR基因，玉米和尖辣椒中有两种，野生燕麦中有三种(Wray和Kinghorn,1989)。烟草NiR的叶和根mRNA比例为3:1(Kato等,2004)，表明叶NiR在硝酸盐同化中发挥更重要的作用。Kato等.(2004)采用定量RT-PCR也证明了4种NiR基因各自的mRNAs均存在于叶和根中但是NiR2和4仅占叶总NiRmRNA的10％。所有四种基因均在硝酸盐处理后被诱导。Morot-Gaudry-Talarmain等(2002)产生了NiR活性被严重抑制的反义NiR烟草植物。这些植物显示显著降低的生长，表明植物中的亚硝酸盐细胞毒性可归因于活性氮种类例如NO(一氧化氮)、N2O(一氧化二氮)和过亚硝酸盐的产生，它们进一步诱导蛋白质和酚环结构中酪氨酸残基的硝化作用。NO释放增加了蛋白质例如14-3-3's和亲环素的合成。NiR活性需要为光合作用产物(Tobin和Bowsher,2005)并且发生在叶绿体基质中的被还原的铁氧还蛋白作为电子供体。通过分离完整的菠菜叶绿体证明了亚硝酸盐还原可由与完整叶中检测到的相似速率的光照引发。干扰PSII后的电子传递链并因此终止被还原的铁氧还蛋白可获得性的DCMU(3(3,4-二氯苯基)-l,l-二甲基脲)抑制这一反应并显示亚硝酸盐还原与非循环电子传递活跃地直接连接/偶合(Mohr和Schopfer,1994)。在根部，硝酸盐同化发生在白色体中。该反应与发生在叶绿体中的反应相似但是由还原等本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产生相对于未修饰的植物亚硝酸盐含量降低的转基因植物的方法，所述方法包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中该外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰的植物降低了该转基因植物中的亚硝酸盐含量，并且其中所述未修饰的植物为烟草，其中所述外源基因包含SEQ ID NO：2定义的核酸序列，或其编码与SEQ ID NO：3定义的多肽具有至少95%氨基酸序列同一性的功能性亚硝酸还原酶的变异体。

【技术特征摘要】
2007.08.15 GB 0715916.31.一种产生相对于未修饰的植物亚硝酸盐含量降低的转基因烟草植物的方法，所述方法包括向未修饰的植物中引入编码亚硝酸还原酶的外源基因，其中该外源基因编码的亚硝酸还原酶的表达相对于未修饰的植物降低了该转基因植物中的亚硝酸盐含量，并且其中所述未修饰的植物为烟草，其中所述外源基因来源于拟南芥菜，且其中所述外源基因是SEQIDNO：2定义的核酸序列，或编码功能性亚硝酸还原酶，其中所述功能性亚硝酸还原酶是SEQIDNO：3定义的多肽。2.任一项前述权利要求的方法，其中由所述外源基因编码的亚硝酸还原酶与未修饰植物中内源基因编码的亚硝酸还原酶具有小于90%的氨基酸序列同一性。3.任一项前述权利要求的方法，其中所述编码亚硝酸还原酶的外源基因与能够引导该外源基因在该植物中组成型表达的启动子序列相连。4.权利要求3的方法，其中所述启动子序列为来源自香石竹蚀环病毒的组成型启动子。5.权利要求1-2和4中任一项的方法，其中通过引入外源基因生成第一代转基因植物，从第一代转基因植物产生第二代转基因植物。6.权利要求5的方法，其中所述第二代转基因植物由第一代转基因植物自体受精产生。7.权利要求6的方法，其中所述第二代转基因植物对于所述编码亚硝酸还原酶的外源基因是纯合的。8.权利要求1-2、4和6-7中任一项的方法，其中通过引入外源基因生...

【专利技术属性】
技术研发人员：S达文波特，M莫恩德斯，
申请(专利权)人：英美烟草投资有限公司，
类型：发明
国别省市：英国;GB