快速检测单增李斯特菌的分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一种快速检测单增李斯特菌的分子标记，为以下引物：RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATggg；RliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。本发明专利技术还同时公开了利用上述分子标记进行的快速检测单增李斯特菌的方法，以待测菌液作为模板进行PCR扩增，所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；当电泳结果为能在500bp左右产生特异条带时，判定待测物中含有单核细胞增生李斯特菌；反之，则判定待测物中不含有单核细胞增生李斯特菌。

【技术实现步骤摘要】
快速检测单增李斯特菌的分子标记
本专利技术涉及快速检测单增李斯特菌的分子标记及其用途。
技术介绍
在我国，食源性疾病中细菌性食物中毒发生率占首位，据统计我国每年发生的细菌性食物中毒事件占食物中毒事件总数的30％～90％，人数占食物中毒总人数的60％～90％，细菌性食物中毒严重危害着人们的身体健康。单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes，单增李斯特氏菌)是一种能引起人畜共患病的致病菌，特别对孕妇、新生儿、老年人和免疫缺陷病人危害严重、致死率高。目前，国际上公认的李斯特菌属共有6个种，即单增李斯特菌(L.monocytogenes)、伊万诺夫李斯特菌(L.ivanovii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、西尔李斯特菌(L.seeligeri)和格氏李斯特菌(L.grayi)。而单增李斯特菌对人类致病性最强，其临床表现为脑膜炎、败血症和孕妇流产等，死亡率高达到20％左右。对人类而言，各年龄组均可感染而发病，但主要是免疫功能低下者最易受该菌感染，可导致脑膜炎、败血症、流产、早产和死胎等后果，病人及无症状携带者也可成为传染源。据国外有关研究报道，由单增李斯特菌引起的食物中毒案例已超过沙门氏菌，但死亡率有时可达20％～50％，被WHO列为20世纪90年代的4大食源性致病菌之一。单增李斯特氏菌抗逆性较强，耐高渗，在酸性、碱性条件下都有较强的生存能力，能在2～42℃下生存，在冰箱冷藏室内(4℃的环境)中仍可较长时间生长繁殖，这使得该菌在环境中分布广泛，肉类、蛋类、禽类、海产品、乳制品、蔬菜等都已被证实是李斯特菌的感染源。人主要通过食入染菌的食物而感染单增李斯特菌，约占85％～90％的病例是由被污染的食品引起的。近年来，欧美国家经常发生食用冷藏食物中毒和李斯特菌病的爆发，同时由于我国食品冷链迅速发展，其对冷藏食品中威胁也日益严重。因此，单增李斯特氏菌已引起了各国对食品中检测该菌的高度关注，是食品安全及食品卫生监测的重要食源性致病菌之一。由于单增李斯特菌在自然界中分布广泛，对食品中单增李斯特菌的及时检测和鉴定成为预防李斯特氏菌食物中毒的有效方法。长期以来，单增李斯特菌的检验方法一直为传统的培养法，该方法先进行增菌，以分离培养得到的可疑菌落做生化反应实验、溶血实验、协同溶血实验(CAMP)等免疫学检测，该方法需要7～11天才能分离鉴定出李斯特氏菌，操作复杂，耗时长，不能适应实际检验工作的需要和快速检测的要求。近年来，为了提高单增李斯特菌的检出灵敏度和检测方法的特异性和简便性，人们利用生物学发展的新技术、新方法研究开发了许多单增李斯特菌检测方法，主要包括API快速反应板方法、显色培养基快速检测方法、免疫学检测方法和PCR法。因此，建立一种快速灵敏、经济的食源性李斯特菌的检测方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种可以简便快速检测单增李斯特菌的方法和所用分子标记，本专利技术首次利用单增李斯特菌非编码RNA的特异性，通过PCR的方法，对单增李斯特菌进行快速检测验证，与其他的李斯特菌以及菌种进行区分；并且此方法无需提取菌种的DNA，可以直接使用菌液来进行PCR。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种快速检测单增李斯特菌的分子标记，为以下引物：RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATgggRliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。本专利技术还同时提供了利用上述分子标记进行的快速检测单增李斯特菌的方法，包括如下步骤：1)、将待测菌液作为下述步骤的模板；2)、PCR扩增PCR反应体系如下：PCR反应程序如下：3)、将上述步骤2)所得的PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；当电泳结果为能在500bp左右产生特异条带时，判定待测物中含有单核细胞增生李斯特菌；反之，则判定待测物中不含有单核细胞增生李斯特菌。本专利技术利用单核细胞增生李斯特菌(L.monocytogenes)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、威尔斯李斯特菌(L.welshimeri)、斯氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、伊氏李斯特菌(L.ivanovii)，提取DNA进行PCR验证，筛选引物。本专利技术使用单核细胞增生李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌以及大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌的菌液进行PCR验证。本专利技术使用筛选出的引物对日常食品(阳性：感染单增李斯特菌；并做阴性对照)进行PCR验证，并且将单增李斯特菌按一定比例稀释后，PCR检测菌的测定限度，并用紫外分光光度计测定原始菌的浓度。本专利技术根据单增李斯特菌非编码RNA的特异性设计引物；从而实现对单增李斯特菌进行快速检测验证，与其他的李斯特菌以及菌种进行区分。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为6种不同李斯特菌的PCR检测示意图；介于图幅的原因，分成了1-1、1-2、1-3这3部分；图1-1中：M:DL2000DNAMarker；1-6依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliA(F)和RliA(R))；7-12依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliB(F)和RliB(R))；13-17依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌(引物为RliC(F)和RliC(R))；图1-2中：M:DL2000DNAMarker；1为单增李斯特菌(引物为RliC(F)和RliC(R))；2-7依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliE(F)和RliE(R))；8-9依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌(引物为RliF(F)和RliF(R))图1-3中：M:DL2000DNAMarker；1-4依次为斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为RliF(F)和RliF(R))；5-10依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为ssrA(F)和ssrA(R))；11-16依次为英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、伊氏李斯特菌、单增李斯特菌(引物为LhrA(F)和LhrA(R))。图2为单增李斯特菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、农杆菌的PCR检测示意图；M:DL2000DNAMarker；1为单增李斯特菌；2为大肠杆菌；3为枯草芽孢杆菌；4为农杆菌。图3是菌液PCR鉴定的可行性探究；M:DL2000DNAMarker；1-6依次为依次为单增李斯特菌、绵羊李斯特菌、英诺克李斯特菌、威尔斯李斯特菌、西尔李斯特菌、格氏李斯特菌。图4是模拟日常食品进行检测；M:DL2000DNAMarker；1-7依次为ddH2O(含单增李斯特菌)、冰红茶(含单增李斯特菌)、冰红茶(不含单增李斯特菌)、可乐(含单增李斯特菌)、可乐(不含单增李斯特菌)、牛奶(含单增李斯特菌)、牛奶(不含单增李斯特菌)本文档来自技高网...

【技术保护点】
快速检测单增李斯特菌的分子标记，其特征在于为以下引物：RliB(F)gAAATAgCTCTTTgAggTAAgATgggRliB(R)gCATAATCCTATgTATAACAggTTTTC。

【技术特征摘要】
1.快速检测单增李斯特菌的分子标记，其特征在于用于检测分子标记的引物为：RliB(F)gAAATAgCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：聂作明，吴程程，王丹，叶小慧，盛清，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33