骨相关间充质干细胞Sca1制造技术

本发明专利技术涉及骨相关间充质干细胞Sca1

【技术实现步骤摘要】
骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备及其应用
本专利技术涉及骨相关间充质干细胞，具体涉及骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备及应用。
技术介绍
骨龛的组成复杂多样，包含了多种细胞成分、细胞外基质成分、氧气张力生长因子、细胞因子，以及维持微环境的pH、离子强度、代谢物等物理化学因素。骨相关间充质干细胞(bone-associatedMSC)是骨龛的组分细胞之一，其具有多种分化潜能，在不同的诱导条件下，骨相关间充质干细胞可以发育为骨细胞、神经细胞、脂肪细胞、肌肉细胞等。
技术实现思路
本专利技术提供的骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备方法包括：利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1+亚群。本专利技术同时还提供了骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于治疗肿瘤相关性贫血的应用。本专利技术还提供了骨相关间充质干细胞Sca1+亚群制备缓解急性移植物抗宿主病的应用。附图说明图1为流式细胞仪鉴定骨相关间充质干细胞Sca1+亚群分选纯化的结果。图2为分选的骨相关间充质干细胞Sca1+亚群，CD271+亚群和SSEA4-1+亚群体外培养5d后检测细胞增殖结果，显微镜放大倍率为400×。图3为骨相关间充质干细胞Sca1+亚群支持造血重建结果；图A为技术路线示意图；图B为克隆形成分析结果；图C为骨髓移植后1-4月HSC重建形成分析，a图为HSC重建分析；b图为T细胞重建分析；c图为髓系细胞重建分析；d图为B细胞重建分析。图4为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠生存曲线比较结果。图5为野生型小鼠(Ctrl)、未治疗组(B16)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)的长骨比较。图6为骨相关间充质干细胞Sca1+亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠外周血检测结果比较；图A为外周血中红细胞计数；图B为外周血中红细胞压积；图C为外周血中血红蛋白的浓度；图中*代表显著性差异程度，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；ns代表没有显著差异。图7为骨相关间充质干细胞Sca1+亚群移植治疗后，野生型(Ctrl)，未治疗组(B16)，混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)小鼠的骨髓中红系细胞发育检测，图A为流式检测图，图B为数据统计分析图。图8为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(MSC)和亚群治疗组(Sca1)的生存曲线比较结果。图9为骨相关间充质干细胞移植治疗后，同种骨髓移植组(Ctrl)，异种骨髓移植组(BM)、混合群治疗组(B16/MSC)和亚群治疗组(B16/Sca1)的临床评分比较结果。具体实施方式造血微环境(Niche)这一概念在1978年由Schofield首先提出。这是一种从低等动物到哺乳动物都存在的造血调控模式。多项研究证实，Niche是调控HSC生理功能的主要功能单位，是HSC的维持和调控依赖的特定细胞微环境。Niche内的多种细胞可通过产生细胞因子，或者细胞直接接触的方式，去调控HSC的自我更新、多向分化和不对称分裂。如Niche内Wnt信号的非经典成员Flamingo和Frizzled分子之间的相互作用，直接参与维持HSC的稳态；抑制Wnt信号同时活化mTOR信号，体内外均可有效维持HSC；内皮细胞来源的Notch受体能促进LT-HSC的增殖；Niche来源的Hedgehog信号参与维持HSC，腺苷脱氨酶信号则可以对抗Hedgehog对HSC的调控作用。目前认为Niche主要有血管龛和骨龛两种经典的结构。血窦内皮龛除了定位于骨髓以外，还存在于肝脏、脾脏等具有血窦结构的器官内；骨龛仅位于骨髓。骨龛通过其构成细胞产生的各种造血相关细胞因子或者信号分子对HSC的增生分化、发育、成熟、迁移、定居、释放、凋亡等活动产生直接影响作用，从而实现对HSC生物学行为的调控。作为Niche的重要组成部分，骨相关MSC不仅对HSC生理功能的调控过程起到了重要作用，而且对各系细胞，尤其是免疫细胞，如T细胞、树突细胞、DC细胞等的分化发育都起到了调节作用。但是骨相关MSC是多种类型细胞组成的混合群细胞，其功能与MSC的来源、分离纯化技术、分选标记都有密切关系。肿瘤相关性贫血(cancerrelatedanemia,CRA)是恶性肿瘤常见的并发症之一，能显著影响临床治疗效果和肿瘤患者生存期。CRA发生的本质是实体肿瘤发生时，红系细胞发育分化的过程异常，导致患者外周血中单位容积内红细胞计数、血红蛋白浓度或红细胞压积异常，即临床症状为贫血。目前临床上CRA的治疗方案主要是采用对症治疗、输血治疗、重组EPO以及铁剂补充等方法。这些治疗方法能暂时改善患者贫血的临床症状，但是并不能完全从根本上治疗CRA。同时这些治疗方法本身还存在一定局限性与副作用。因此如果能够从根本上，即从影响红系细胞的生成发育过程的因素对CRA进行治疗，可能会大大提高CRA的治疗效果。造血微环境是调控红系生成发育的重要因素之一，而骨相关MSC作为其重要组成部分，也参与了红系生成发育得调控。因此以其作为CRA治疗的靶向目标，不仅能从根本上对CRA起到治疗作用，同时还会减低CRA的复发率，最终提高肿瘤患者的生存治疗。造血干细胞移植是治疗血液恶性疾病的有效途径，然而并发症移植物抗宿主病(graftversushostdisease,GVHD)的发生成为阻碍造血干细胞移植成功的主要原因。接受异体移植物的受体发生急性移植物抗宿主病(acutegraftversushostdisease,aGVHD)的概率是50％，其中不到20％的人移植后能存活超过5年，尤其是抗固醇类aGVHD能导致90％的致死率。目前，临床上采用多种细胞治疗方法预防或治疗GVHD，其中包括不同来源的MSCs。但是目前诱导移植免疫耐受时多使用MSCs混合群，而MSCs亚群众多，功能差异较大，为了使MSCs在临床上得到更好的应用，需要探索MSCs各细胞亚群在免疫耐受诱导中的作用以及机制。专利技术人意外地发现，将从小鼠胫骨、股骨上得到的骨相关MSC利用专利技术人独创的分选标记对其进行分选鉴定，获得了较高纯度的Sca1+亚群细胞。专利技术人意外的发现，上述获得的Sca1+亚群细胞可以在体外培养并增殖；并且参与支持造血重建。专利技术人利用分选得到的Sca1+亚群细胞对CRA模型小鼠进行治疗，发现治疗后的模型小鼠外周血贫血症状被纠正，同时改善了骨髓中红系前体细胞发育异常的情况；且治疗效果比混合群细胞明显。专利技术人利用分选得到Sca1+亚群细胞对aGVHD小鼠模型进行治疗，发现治疗后的模型小鼠aGVHD临床症状有所改善，生存时间延长；且治疗效果比混合群细胞明显。实施例1.骨相关间充质干细胞制备1、取小鼠股骨和胫骨，去除所有肌肉组织，PBS冲洗骨头后，放于研磨杯内研磨至骨髓释放，分离收集骨髓待用。加入PBS冲洗骨头，再次研磨和冲洗，直到骨头全部变成白色；2本文档来自技高网...

【技术保护点】
骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备，其特征在于，包括：利用抗‑CD45抗体、抗‑Ter119抗体和抗‑Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1+亚群。

【技术特征摘要】
1.骨相关间充质干细胞Sca1+亚群用于制备治疗肿瘤相关性贫血药物的应用；所述骨相关间充质干细胞Sca1+亚群的制备包括：利用抗-CD45抗体、抗-Ter119抗体和抗-Sca1抗体对骨相关间充质干细胞进行分选得到骨相关间充质干细胞Sca1+亚群。2...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡兴斌，安宁，文凡，尹文，张辉洁，陈要臻，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61