高效非整合性人类iPSC诱导平台制造技术

本发明专利技术公开了高效非整合性人类iPSC诱导平台。包括用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。在前诱导剂组合物作用下，iPSC的前诱导效率达6.4%。通过后诱导培养，可以将全培养物诱导达到20.8%，或者将前诱导物克隆全部进一步诱导为接近ESC的人类iPSC克隆。诱导效率远高于现有技术，得到的iPSC成熟度高，无外源基因插入，细胞形态、性能更接近于ESC，稳定性好，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
高效非整合性人类iPSC诱导平台
本专利技术涉及一种将人类体细胞诱导为iPSC的诱导剂、诱导方法及诱导培养基。
技术介绍
iPSC的成功诱导是干细胞研究的一个重大突破，iPSC解决了人ESC研究中存在的伦理学等问题，避开了核移植技术缺乏人卵母细胞的难题，为干细胞和再生医学的临床应用提供新的种子细胞来源；同时，也为发育生物学、疾病发生发展机制、基因与蛋白质功能研究以及药物筛选等提供重要的研究平台。现有将体细胞诱导为iPSC方法有多种，如基因敲除、整合外源基因、细胞因子诱导或其结合。基因敲除、在基因组中整合外源基因会改变基因组，导致得到的iPSC不够稳定，存在极大的癌变可能，这些风险的存在阻碍了其应用。2007年日本、美国的科学家(Takahashietal.2007；Yuetal.2007；Parketal.2008)相继报道，在人类体细胞中通过逆转录病毒（或慢病毒）过表达四个转录因子基因（Oct4，Sox2，Klf4与c-Myc，或者Oct4，Sox2，Nanog与Lin28），逆转人类成体细胞的分化状态，获得多能潜能干细胞（iPSC，inducedpluripotentstemcell）。有报道证实，通过病毒载体导入Oct3/4和Sox2两种转录因子基因，即可将体细胞重编程为多潜能干细胞（DanweiHuangfu，2008）。2009年3月5日，Cell报道RudolfJaenisch研究组利用Cre-重组酶系统使诱导成功的帕金森病人iPSC无外源因子，使iPSC临床应用又推进了一步。2009年3月26日，Science报道俞君英等通过一种非整合质粒EpisomalVector成功诱导出无外源基因也无载体整合到基因组上的iPSC（俞君英等人，无载体也无外源基因序列的人的诱导多能干细胞，科学，2009.324:7797-801）。人类体细胞重编程为多潜能干细胞（iPSC）是近两年来干细胞研究领域的重要里程碑事件。在2007-2008年连续两年被science杂志评为十大科学进展(Kennedy2007；Vogel2008)。多种研究表明，通过引入利于iPSC诱导的外源基因，有助于将体细胞诱导为iPSC。特别的，使用附加型（非整合型）载体转染外源基因，可以有效避免外源基因整合到基因组中，安全性有所提高，日益受到人们的重视。纯化学试剂诱导iPSC完全避免了引入外源基因，具有更高的安全性，日益成为iPSC研究中的热点。小鼠体细胞是进行iPSC诱导研究时常用的对象，人们从其中获得了大量的研究数据。Yingetal，2008指出，包含糖原合酶激酶和丝裂原活化蛋白激酶信号抑制剂的（2i）培养基可以维持小鼠ES细胞处于基态。2013年7月18日，北京大学生命科学学院邓宏魁教授和赵扬博士带领的研究团队在《Science》杂志上发表了题为“PluripotentStemCellsInducedfromMouseSomaticCellsbySmall-MoleculeCompounds”的文章。文章中他们仅使用4个小分子化合物的组合对体细胞进行处理，成功逆转其“发育时钟”，重新赋予体细胞“多潜能性”，为诱导体细胞成为多能性干细胞提供了更加简单和安全的方法。此项工作之前，该研究小组报道了一种将多种小分子化合物“VC6T”[VPA，CHIR99021(CHIR)，616452，Tranylcypromine]联合Oct4单个外源基因导入实现小鼠体细胞重编程的方法。通过在小鼠成纤维细胞（mouseembryonicfibroblasts，MEFs）中转入由OCT4启动子启动GFP表达的质粒系统（Oct4promoter-drivenGFPexpression，OG），利用启动GFP表达对10000多种化学小分子进行筛选，选出了For-skolin(FSK)等OCT4“替代物”。随后，研究人员对多种化合物组合进行优化，并通过添加DZNep，一种已知可促成晚期重编程阶段的化合物，得到了完全重编程的细胞，并最终利用7个化合物组合的混合物，将重编程效率提高至0.2%，与目前常用的建立小鼠iPS细胞的技术相当。由于遗传背景和培养条件差异过大，我们和别人的研究表明适用于小鼠的iPSC诱导条件根本无法应用于人iPSC的诱导，还没有化学诱导人类iPS细胞的成功报道。目前发展的游离体载体等诱导方法用于人类iPSC的诱导也能成功，并且比较安全，但是与小鼠的iPS细胞的诱导效率更低，只有0.1～1%。开发出高效安全的将人体细胞诱导为iPSC的技术具有非常实际的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以将人体细胞高效诱导为iPSC的组合物及培养方法。本专利技术所采取的技术方案是：用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。作为本专利技术的进一步改进，上述前诱导剂和后诱导剂中，转化生长因子β抑制剂选自E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin、LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDE1、ITD1、SD208、A83-01。作为本专利技术的进一步改进，上述组合物中，糖原合成酶激酶3抑制剂选自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone、TCG24、TCS2002、FRATide、Indirubin-3’-oxime、ARA-A014418、BIO、MeBio。作为本专利技术的进一步改进，上述组合物中，cAMP激动剂选自Forskolin、NKH477。作为本专利技术的进一步改进，上述组合物中，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂选自DZNep、UNC0224、UNC0642、UNC0646、UNC0638、SGC0946、PFI2、C21、TC-E5003、Chaetocin、BIX01294。作为本专利技术的进一步改进，上述组合物中，p21活化激酶抑制剂选自IPA-3、FRAX486。作为本专利技术的进一步改进，上述组合物中，选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂选自PD0325901、10Z-Hymenialdisine、PD184352、PD198306、PD334581、SL327、U0126。一种将人体细胞诱导为iPSC的方法，包括如下步骤：1)将人体细胞置于转染培养液中，加入附加型载体及至少一种有利于iPSC诱导的外源基因进行转染培养；2)将转染后的细胞恢复培养，之后加入ESC培养液中，添加前诱导剂进行诱导培养，得到前诱导培养细胞；3)将前诱导培养细胞置于添加有后诱导剂的ESC培养液中，继续培养得到iPSC；前诱导剂和后诱导剂的组成如上所述。作为上述将人体细胞诱导为iPSC方法的进一步改进，有利于本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S‑腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。

【技术特征摘要】
1.用于将人体细胞诱导为iPSC的组合物，由前诱导剂和后诱导剂组成，其中，前诱导剂的活性成分为：转化生长因子β抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、cAMP激动剂、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂和p21活化激酶抑制剂；后诱导剂的活性成分为：糖原合成酶激酶3抑制剂、选择性ATP非竞争性的MEK抑制剂和S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：转化生长因子β抑制剂选自E-616452、SB431542、LDN193189、Dorsomorphin、LY2109761、LY2157299、SB525334、SB505124、GW788388、LY364947、D4476、IDE1、ITD1、SD208、A83-01。3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：糖原合成酶激酶3抑制剂选自CHIR-99021、TWS119、SB216763、CHIR-98014、Tideglusib、SB415286、LY2090314、AZD1080、3F8、L308、NSC693868、Kenpaulone、TCG24、TCS2002、FRATide、Indirubin-3’-oxime、ARA-A014418、BIO、MeBio。4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：cAMP激动剂选自Forskolin、NKH477。5.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶抑制剂选自D...

【专利技术属性】
技术研发人员：林同香，徐洋，吴寿海，
申请(专利权)人：广东省中医院，
类型：发明
国别省市：广东;44