一种苹果酸酶基因及其重组表达载体制造技术

一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，本发明专利技术公开了一种从深黄被孢霉M6-22中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中表达，表达产物具有苹果酸酶功能。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果酸酶基因及其重组表达载体
本专利技术涉及一种苹果酸酶基因及其重组表达载体，具体涉及从（Mortierellaisabellina）M6-22中克隆的苹果酸酶基因以及将该基因直接与不同载体连接，转入不同宿主细胞中，利用其编码苹果酸酶催化苹果酸脱羧，伴随着产生丙酮酸、CO2和NADPH，其产生的NADPH具有提高植物光合作用速率、促进脂肪酸的合成等功能，属于微生物基因工程领域。
技术介绍
苹果酸酶（malicenzyme，ME）是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧，伴随着产生丙酮酸和CO2以及NAD(P)+的还原。苹果酸酶广泛存在于动物、植物、真菌和细菌中。根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种：NAD-苹果酸酶（NAD-Malicenzyme，NAD-ME，EC1.1.1.38和EC1.1.1.39）和NADP-苹果酸酶（NADP-Malicenzyme，NADP-ME，EC1.1.1.40）。本专利技术主要是针对NADP-苹果酸酶基因进行研究。通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH（SongYD,WynnJP,etal,Microbi,2001,147（6）:1507-1515.）。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的pH和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(DrincovichMF,CasatiP,AndreoCS,FEBSLetters,2001,490:1-6.4;MartinoiaE,RentschD,AnnualReviewofPlantPhysiologyandPlantMolecularBiology,1994,45:447-467.)。此外，植物NADP-ME被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。NADP-ME也是景天酸代谢途径（CAM）植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明：NADP-ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17（2）:200-204.)。苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本专利技术通过发掘高效、特异性新苹果酸酶基因MIME2，进一步将其插入pET-32a(+)构建重组表达质粒，并实现在E.coliBL21中表达重组苹果酸酶，为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从深黄被孢霉（Mortierellaisabellina）M6-22中分离的苹果酸酶基因MIME2及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQIDNO：1所示或该核苷酸序列的片段，或与SEQIDNO：1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1815bp（碱基），其中1-1815为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示的多肽或其片段。本专利技术另一目的是提供一种含有所分离的苹果酸酶基因MIME2的重组表达载体，是将SEQIDNO：1所示基因直接与不同表达载体（质粒、病毒或运载体）连接所构建的重组载体。本专利技术另一目的是提供一种含有该苹果酸酶基因MIME2或上述重组表达载体的宿主细胞大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株BL21。本专利技术提供的核苷酸序列是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，可以将其与载体连接后转化至微生物细胞体内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受场地、气候、季节的影响及利用不同的菌种和培养基适合开发商业化苹果酸酶等优点。本专利技术应用基因工程技术构建特异性生产苹果酸酶的转基因大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。附图说明图1为利用本专利技术的深黄被孢霉M6-22苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32aMIME2质粒图谱；图2为本专利技术所构建重组表达质粒pET32aMIME2的酶切分析图；其中：1为DNAMarker；2为基因MIME2的PCR扩增产物；3为pET32aMIME2酶切后条带；4为pET32a(+)酶切后条带；图3为本专利技术的苹果酸酶基因MIME2诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图，其中：1为1为蛋白电泳Marker；2为转化了pET32a(+)并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了pET32aMIME2并经IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。具体实施方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。实施例1：深黄被孢霉苹果酸酶基因MIME2的克隆采用OMEGA试剂盒E.Z.N.AFungalRNAKit从深黄被孢霉(Mortierellaisabellina)中提取总RNA，用反转录试剂盒ThermoScientificMaximaHMinusFirstStrandcDNASynthesisKit合成cDNA，取1ul为模板进行聚合酶链式反应。设计引物（引物1和引物2）进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下：引物1：MIME2F2：5`-CGGGATCCATGCTGCAAAGACGTTTGGC-3`（SEQIDNO:3）引物2：MIME2R2：5`-CCCTCGAGTTAGGGAGAATAGACCAGAGG-3`（SEQIDNO:4）PCR扩增体系（50μL）组成如下：5×FastPfuBuffer10μLdNTP（2.5μmol/L）5μLcDNA1μLMIMEF1（10μmol/L）1μLMIMER1（10μmol/L）1μLFastPfuDNApolymerase（5U/μL）1μL无菌ddH2O补足至50μL；扩增条件：94℃变性4min，再用94℃45s、57.5℃45s、72℃2min进行30个循环，最后72℃10min，反应完后取产物1μL，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转化大肠杆菌DH5α，用含有氨苄青霉素(Amp+)的LB固体平板进行筛选，挑取平板上的转化子进行菌落PCR筛选阳性克隆，然后送去上海生工测序。测序结果显示，获得一段1815bp长的序列，命名为MIME2，序列组成如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种苹果酸酶基因MIME2，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2 所示。

【技术特征摘要】
1.一种苹果酸酶基因MIME2，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。2.一种含有权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，崔锦锦，李凌彦，魏云林，林连兵，季秀玲，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53