用于核酸组装和高通量测序的方法技术

本发明专利技术的一些方面的方法和设备涉及高保真多核苷酸的合成。具体而言，本发明专利技术的各方面涉及同时进行酶促去除扩增序列和将经加工的寡核苷酸连接成核酸组装体。根据一些实施方式，该方法包括提供多个寡核苷酸的步骤，其中各寡核苷酸包含(i)与目标核酸序列的不同部分相同的内部序列，(ii)该内部序列5’端之侧的5’序列和在该内部序列3’端之侧的3’侧接序列，各所述侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性酶识别位点。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】 相关申请 本申请要求2012年6月25日提交的美国临时专利申请号61/664, 118和2012年 11月30日提交的美国临时专利申请号61/731，627的权益和优先权，上述各申请通过引用 全文纳入本文。
本文提供了涉及合成和组装有预定序列的高保真核酸和核酸库的方法和设备。更 具体的，提供了用于多核苷酸合成、错误降低和/或高通量测序验证的方法和设备。 专利技术背景 使用重组DNA化学技术，从自然中复制和扩增DNA序列并随后分解成组成部分是 常见的。作为组成部分，随后序列重组或重新组装成新的DNA序列。然而，对天然可得序列 的依赖性严重限制了研究者探索的可能性。虽然现在可以从单个核苷直接合成短DNA序 列，但通常直接构建多核苷酸的大片段或组件（即长于约400碱基对的多核苷酸序列）是 不可行的。 能通过微芯片上的大规模平行定制合成进行寡核苷酸合成（Zhou等，（2004) Nucleic Acids Res. 32:5409 ;Fodor 等（1991)Science 251:767)。然而，当前微芯片的表 面积非常小，并且因而仅能生成少量的寡核苷酸。在释放到溶液中时，寡核苷酸以每条序列 皮摩尔或更低浓度存在，该浓度不足以有效驱动双分子活化反应。无法对目前用于组装少 量变体核酸的方法以成本节约的方式进行放大以生成大量特定的变体。同样，仍然需要用 于商保真基因组装等的改良的方法和装置。 此外，通常通过化学反应合成微芯片上的寡核苷酸。错误的化学反应导致寡核苷 酸中随机的碱基错误。化学核酸合成中关键限制因素之一是错误率。化学合成的寡核苷酸 的错误率（例如每100个碱基中1个的缺失和约每400个碱基中1个的错配和插入）超过 了通过酶的方式复制现有核酸（例如PCR)所得的错误率。因此，迫切需要一种新的技术来 以成本节约的方式生产高产量的高保真多核苷酸。 概述 本专利技术的各方面涉及制备和/或组装高保真聚合物的方法、系统和组合物。本发 明还提供了进行核酸组装反应和组装核酸的设备和方法。本专利技术的一个目的是提供合成定 制多核苷酸的可行、经济的方法。本专利技术的另一个目的是提供生产合成的多核苷酸的方法， 该方法的错误率低于通过本领域已知方法制备的合成的多核苷酸。 根据一些实施方式，本专利技术提供了一种用于生产具有预定序列的目标核酸的方 法。在一些实施方式中，该方法包括提供多个寡核苷酸的步骤，其中各寡核苷酸包含（i)与 目标核酸的序列的不同部分相同的内部序列，（ii)内部序列5'端之侧的5'侧接序列和内 部序列3'端之侧的3'侧接序列，各侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性酶识别 位点。在一些实施方式中，该方法还包括使用引物对扩增至少一组寡核苷酸，从而生成多个 经扩增的寡核苷酸。随后可使多个经扩增的寡核苷酸在单个池中接触限制性酶和连接酶， 其中限制性酶能够识别限制性酶识别位点，从而生成目标核酸。 在一些实施方式中，该方法包括对组装的目标核酸进行测序确认。在一些实施方 式中，经扩增的双链寡核苷酸可包含一个序列错误或错配。在一些实施方式中，该方法包括 对多个经扩增的寡核苷酸进行错误去除。在一些实施方式中，可使多个经扩增的寡核苷酸 接触错配结合剂。所述错配结合剂可选择性地结合包含错配的双链寡核苷酸，导致结合和 剪切作用。在一些实施方式中，可使多个经扩增的寡核苷酸接触错配识别剂，例如化学品， 如赖氨酸、哌啶等。 在一些实施方式中，在适于促进消化和连接的条件下将限制性酶和连接酶加入单 个经扩增的寡核苷酸的池中，从而生成包含组装的目标核酸序列和侧接区的混合物。在一 些实施方式中，各侧接区包含共有的引物识别位点。在一些实施方式中，所述限制性酶是 IIS型限制性酶。使用IIS型限制性酶进行消化可产生多个粘性末端的双链结构寡核苷酸 且所述多个粘性末端的双链结构寡核苷酸可以特定的线性排列形式进行连接。 在一些实施方式中，该方法包括使用能够识别位于目标核酸的5'端和3'端的引 物识别位点的引物对扩增目标核酸。在一些实施方式中，该方法包括对目标核酸进行测序 以确认其序列准确性，例如通过高通量测序。在一些实施方式中，该方法包括从核酸序列池 中分离至少一种具有预定序列的目标核酸。 根据一些实施方式，本专利技术提供了一种进一步加工分离的核酸的方法。在一些实 施方式中，该方法包括组装至少两种目标核酸。组装的步骤可以是通过分级组装。在一些 实施方式中，可对至少两种目标核酸进行限制性酶消化和连接，从而形成长的目标核酸构 建体，例如长度至少约10千碱基或100千碱基。 根据一些实施方式，本专利技术提供了一种用于生产载体中具有预定序列的目标核酸 的方法。在一些实施方式中，提供了多个寡核苷酸，各寡核苷酸包含（i)与目标核酸的序列 的不同部分相同的内部序列，（ii)内部序列5'端之侧的5'侧接序列和内部序列3'端之侧 的3'侧接序列，各侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性内切酶的限制性酶识别位 点。在一些实施方式中，可使用引物对扩增至少一组寡核苷酸，从而生成多个经扩增的寡核 苷酸。在一些实施方式中，可对多个经扩增的寡核苷酸进行错误去除和/或校正。在一些实 施方式中，提供了具有限制性内切酶的限制性酶识别位点的环形载体。在一些实施方式中， 可使多个经扩增的寡核苷酸和环形载体在单个池中接触限制性酶和连接酶，其中限制性酶 能够识别限制性酶识别位点，从而在载体中组装目标核酸。在一些实施方式中，该方法还包 括将载体转化至宿主细胞中并测序以验证目标核酸序列。 根据一些实施方式，本专利技术提供了一种用于组装具有预定序列的目标核酸的组合 物。在一些实施方式中，所述组合物包含多个寡核苷酸，其中各寡核苷酸包含（i)与目标核 酸的序列的不同部分相同的内部序列，（ii)内部序列5'端之侧的5'侧接序列和内部序列 3'端之侧的3'侧接序列，各侧接序列包含引物对的引物识别位点和限制性内切酶的限制性 酶识别位点。在一些实施方式中，所述组合物还包含限制性内切酶和/或连接酶。在一些 实施方式中，所述组合物还包含载体，所述载体包含限制性内切酶的一对酶识别位点。在一 些实施方式中，所述限制性内切酶是IIS型限制性内切酶。 在一些实施方式中，对多个寡核苷酸进行扩增和/或错误校正。 在本专利技术的一些方面中，生成具有预定序列的目标核酸的方法包括提供第一混合 物，其包含（i)限制性酶和（ii)第一寡核苷酸池，所述第一寡核苷酸池包括：包含与目标核 酸5'端相同序列的第一寡核苷酸、包含与目标核酸3'端相同序列的第二寡核苷酸和包含 与目标核酸序列另外部分相同序列的多寡核苷酸组，各寡核苷酸具有对应于下一寡核苷酸 中序列区域的重叠序列区域，第一池中的寡核苷酸合起来包含目标核酸序列；并使混合物 与连接酶接触，从而生成目标核酸。随后可对目标核酸进行测序验证。 在一些实施方式中，本专利技术的方法包括提供一个构建寡核苷酸池并涉及不同阶段 时寡核苷酸的扩增。术语"构建寡核苷酸"指可用于组装比构建寡核苷酸本身长的核酸分 子的单链寡核苷酸。构建寡核苷酸可以是单链寡核苷酸或双链寡核苷酸。在一些实施方式 中，构建寡核苷酸是合成的寡核苷酸并可以在基质上平行地合成。 在一些实施方式中，该方法还包括在提供第一混合物前提供多个构建寡核苷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生成有预定序列的目标核酸的方法，所述方法包括：a)提供第一混合物，所述第一混合物包含(i)第一寡核苷酸池，所述第一寡核苷酸池包含：包含与所述目标核酸5’端相同序列的第一组多个寡核苷酸、包含与所述目标核酸3’端相同序列的第二组多个寡核苷酸和包含与目标核酸序列的另外部分相同序列的多寡核苷酸组，所述寡核苷酸各自具有对应于下一个寡核苷酸中序列区域的重叠序列区域，所述第一混合物中的寡核苷酸合起来包含所述目标核酸序列；(ii)限制性酶，以及b)使所述第一混合物接触连接酶，从而生成所述目标核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·E·赫德森，L·A·昆，D·辛德勒，S·阿彻，I·萨奥尔默，
申请(专利权)人：GEN九股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US