检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法技术

本发明专利技术新型公开了一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：HRM反应预混液；dNTPs混合液；Taq聚合酶；上游引物；下游引物；荧光染料；DNA模版；水。本发明专利技术一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：提取样品DNA；对样品DNA进行多重荧光PCR扩增，扩增后对产物进行HRM分析后判定结果。本发明专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本低的检测食源性致病菌的试剂盒；本发明专利技术另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性致病菌的方法，而且检测结果准确。

【技术实现步骤摘要】
检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法
本专利技术涉及一种检测食源性致病菌的试剂盒及多重荧光PCR检测方法；该检测方法结核高分辨率熔解曲线HRM分析和荧光PCR技术，本方法可检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌及大肠杆菌O157:H7五种主要食源性致病菌中的一种或两种以上至五种食源性致病菌，属于微生物检测领域。
技术介绍
2014年7月1日，国家卫计委发布的强制性食品安全标准“GB29921-2013《食品中致病菌限量》”正式实施，该标准涉及五种食源性致病菌，即本专利所述沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌以及大肠杆菌O157:H7。其中，沙门氏菌(Salmonella)属肠杆菌科，革兰氏阴性肠道杆菌，已发现的近一千种。沙门氏菌病除可感染人外，还可感染很多动物，包括哺乳类、鸟、爬行类、鱼、两栖类及昆虫。人畜感染后可呈无症状带菌状态，也可表现为有临床症状的致死疾病。蛋、家禽和肉类产品是沙门氏菌病的主要传播媒介，该病受威胁最大的是小孩、老年人及免疫缺陷个体。根据国际惯例，要求对易受沙门氏菌污染的食品进行分类管理，从而有效预防沙门氏菌病。副溶血弧菌(VibrioParahemolyticus)，是一种嗜盐性细菌，系弧菌科弧菌属，革兰染色阴性。进食含有该菌的食物可食物中毒，也称嗜盐菌食物中毒，主要来自海产品。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。副溶血性弧菌主要来源于鱼、虾、蟹、贝类和海藻等海产品。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属，有“嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染。金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因此，食品受到污染的机会很多。美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83％，所以人畜化脓性感染部位，常成为污染源。单增李斯特菌是是某些食物(主要是鲜奶产品)中的一种污染物，能引起严重食物中毒。也是一种人畜共患病的病原菌。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。荧光PCR检测技术大致分为两大类：荧光探针法(标记荧光PCR)和非标记荧光染料法。前者则利用荧光标记的特异性探针或者引物来识别模板，优点是特异性更高，适用于扩增序列专一检测，不过检测成本高。后者主要是利用荧光染料与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加，无需另外合成探针，简便易行，成本较低。相对以往普通非探针标记荧光PCR所用非饱和染料，新型饱和燃料(如LCGreen等)具有以下优点：①新型饱和染料对PCR反应没有任何抑制作用。②DNA高温变性时，非饱和荧光染料加入则会造成DNA双链高温变性时，单链部分的荧光染料分子发生迁移，荧光染料分子重新结合到双链DNA的空置位点，造成荧光信号没有变化，因此出现假阴性，特异性下降，而饱和染料则不会出现此类情况。③高温稳定，对于高GC含量的PCR产物，在DNA双链高温熔解时，饱和荧光染料结合核酸更稳定。目前，食源性致病菌的检测方法主要有传统的培养方法和分子检测方法。其中传统的培养分离检测方法，依赖于生化和形态学特点，我国以GB4789系列国家食品安全标准作为经典方法，规范了食源性致病菌传统培养检测方法，分子检测方法则主要为SN/T1870-2007《食品中致病菌检测方法实时PCR法》。但传统培养法存在操作繁琐、耗时长、易漏检等缺点。分子检测方法包括了常规PCR方法和探针法荧光PCR方法，常规PCR需要扩增后进行电泳，操作复杂且易引起污染。而探针法PCR则存在检测成本很高，试剂保存期短等缺点。研究人员对此已开展了许多方法研究，但是同时针对这五种食源性致病菌开展多重荧光PCR检测的研究尚未见报道
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中的不足之处，提供一种操作简便、快速，成本低的检测食源性致病菌的试剂盒；本专利技术另一个目的是提供一种采用上述试剂盒的多重荧光PCR检测主要食源性致病菌的方法，而且检测结果准确。为了达到上述目的，本专利技术采用以下方案：一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16sRNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16sRNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’。如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’。如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA下游引物LMOR：5‘-GTTCCTCCACATATCTACGC-3’。如上所述的一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于所述上游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE上游引物O157F：5‘-GCTTTGTTAGCGTTAGGT-3’，所述下游引物还包括大肠杆菌0157:H7目的基因rfbE下游引物O157R：‘-GACATTTGCCAAGTTTCA-3’。本专利技术一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、提取样品DNA；B、对样品DNA进行多重荧光PCR扩增，其中在所述荧光定量PCR反应中所采用的反应液，包含下列成分：C、扩增后对产物进行HRM分析后判定结果。如上所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤B中对所有致病菌检测时PCR扩增的反应程序按以下步骤进行：(1)92℃～96℃预变性30s；(2)92℃～96℃变性10～30s，55℃-63℃退火10～30s，72℃10～30s，共进行40～50个循环；(3)72℃延伸10～30s。如上所述的一种多重荧光PCR检测方法，其特征在于步骤C中对PCR扩增产物进行HRM分析，按以下步骤进行：(1)92℃～96℃变性1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测食源性致病菌的试剂盒，其特征在于由以下组分组成：

【技术特征摘要】
1.一种食源性致病菌的检测方法，其特征在于包括以下步骤：A、根据食源性致病菌设计引物对；B、提取样本DNA后，利用设计的引物对进行荧光PCR扩增；其中所述样本为食物样品；C、应用带HRM模块的荧光定量PCR仪对PCR扩增产物进行HRM分析，确定扩增产物Tm值；其中步骤B中进行非标记荧光PCR扩增过程中的反应液由以下组分组成：所述的上游引物包括沙门氏菌目的基因16sRNA上游引物SLMF：5‘-GGTGAAGGATTTAACCGTGAACTT-3’；所述下游引物包括沙门氏菌目的基因16sRNA下游引物SLMR：5‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’；所述上游引物还包括金黄色葡萄球菌的目的基因16sRNA上游引物SPAF：5‘-CCTAATCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括黄色葡萄球菌的目的基因16sRNA下游引物SPAR：5‘-AGTTTCCAATGACCCTCC-3’；所述上游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH上游引物VPF：5‘CAAACCAGCAAACACCTT-3’；所述下游引物还包括副溶血性弧菌目的基因TLH下游引物VPR：5‘GTCCGTCAAACGAATCAG-3’；所述上游引物还包括单增李斯特菌目的基因16sRNA上游引物LMOF：5‘-ATCTAACCAGAAAGCCACG-3’，所述下游引物还包括单增李斯特菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡先全，李蓉，邱德义，鱼海琼，柏建山，岳巧云，赵美转，萧绮倩，张磊，
申请(专利权)人：蔡先全，
类型：发明
国别省市：广东;44