本发明专利技术涉及一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：构建两种针对mir-505基因的打靶载体，在哺乳动物细胞中通过CRISPR/Cas系统介导打靶载体对mir-505基因进行替换敲除，利用G418抗性筛选得到mir-505单等位基因敲除细胞，并在该细胞基础上再一次利用CRISPR/Cas系统和绿色荧光打靶载体作用对另一条mir-505进行敲除，通过荧光筛选得到mir-505双等位基因敲除的细胞。本发明专利技术为构建基因彻底敲除细胞模型提供帮助，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一种mir-505双等位基因敲除的方法
本专利技术属于基因敲除领域，特别涉及一种mir-505双等位基因敲除的方法。
技术介绍
1987年，日本课题组在E.coliK12的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[IshinoY，ShinagawaH，MakinoK，etal.Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduce.JBacteriol,1987,169(12):5429-5433]，在之后的研究中发现这类间隔重复序列广泛存在于细菌和古生菌的基因组中，在2002年，被科学家正式命名为规律成簇间隔短小回文重复序列(CRISPR)[JansenR,vanEmbdenJD,GaastraW,etal.Identificationofanovelfamilyofsequencerepeatsamongprokaryotes.Omics:ajournalofIntearativeBiology,2002,6(1):23-33]、[MojicaFJ,FerrerC,JuezG,etal.LongstretchesofshorttandemrepeatsarepresentinthelargestrepliconsofthearchaeaHaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiandcouldbeinvolvedinrepliconpartitioning.MolMicrobiol,1995,17(1):85-93]、[JansenR,EmbdenJD,GaastraW,etal.IdentificationofgenesthatareassociatedwithDNArepeatsinprokaryotes.MolMicrobiol,2002,43(6):1565-1575]。CRISPR发现是一种细菌和古生菌的一种免疫系统，它是由一列短小的保守重复序列被具有相似大小的独特的DNA序列所间隔，一种独特的DNA序列叫做间隔区，这些间隔区通常来源于噬菌体或质粒DNA。CRISPR列和Cas(CRISPR-associated)基因形成CRISPR-Cas适应免疫系统[Horvath,P.andBarrangou,R.(2010)CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea.Science327,167–170]、[Barrangou,R.etal.(2007)CRISPRprovidesacquiredresistanceagainstvirusesinprokaryotes.Science315,1709–1712]、[Gasiunas,G.etal.(2013)MolecularmechanismsofCRISPR-mediatedmicrobialimmunity.CellMol.LifeSci.http://dx.doi.org/10.1007/s00018-013-1438-6]。CRISPR/Cas系统的功能是这样行使的：将入侵的核酸片段作为间隔区合并入宿主基因组，随后将这些间隔区作为模板，产生小RNA分子(crRNA)，这些crRNA能够和Cas蛋白结合成为效应复合物，它能够在下一轮的侵染中将外源核酸沉默掉。TypeII系统仅仅需要Cas9蛋白(以前称为Cas5或Csn1)就可以用于DNA干扰[MojicaFJ,Diez-VillasenorC,Garcia-MartinezJ,etal.Interveningsequencesofregularlyspacedprokaryoticrepeatsderivefromforeigngeneticelements.JMolEvol,2005,60(2):174-182]、[Sapranauskas,R.etal.(2011)TheStreptococcusthermophilusCRISPR/CassystemprovidesimmunityinEscherichiacoli.NucleicAcidsRes.39,9275–9282]、[Deltcheva,E.etal.(2011)CRISPRRNAmaturationbytrans-encodedsmallRNAandhostfactorRnaseIII.Nature471,602–607]、[Garneau,J.E.etal.(2010)TheCRISPR/CasbacterialimmunesystemcleavesbacteriophageandplasmidDNA.Nature468,67–71]。TypeII系统进行靶基因的双链断裂的步骤：(i)pre-crRNA和tracrRNA从CRISPR位点被转录下来；(ii)tracrRNA和pre-crRNA中的正向重复序列杂交形成双链，并与Cas9结合，pre-crRNA通过RNaseIII和某未知核酸酶作用形成成熟的crRNA。该成熟的crRNA中包含有短的间隔序列；(iii)成熟crRNA:tracrRNA杂交双链引导Cas9蛋白到靶DNA位点，DNA靶点需含有protospacer和必需的PAM(protospaceradjacentmotif)，这一过程是通过crRNA的间隔序列于protospacerDNA间形成杂化双链来完成；(iv)Cas9蛋白介导靶位DNA中PAM上游进行剪切，在protospacer中进行双链断裂。2010年，VerduciL等发现miR-505能通过作用于其靶标ASF/SF2(可变剪接因子)发挥调控小鼠胚胎成纤维细胞的增殖和衰老/凋亡的作用[Verduci,L,SimiliM,RizzoM,MercatantiA,EvangelistaMetal.(2010)MicroRNA(miRNA)-mediatedInteractionbetweenLeukemia/Lymphoma-relatedFactor(LRF)andAlternativesplicingfactor/splicingfactor2(ASF/SF2)affectsmouseembryonicfibroblastsenescenceandapoptosis.JBiolChem,285:39551-39563]，KarniR等发现在许多细胞中转染ASF/SF2可以激活mTOR部分信号通路[KarniR,HippoY,LoweSW,KrainerAR(2008)Thesplicing-factoroncoproteinSF2/ASFactivatesmTORC1.ProcNatlAcadSciUSA105(40):15323-15327]，但是ASF参与调控mTOR的具体方式还不清楚。YamamotoY等在研究肿瘤多药抗性时，发现miR-505是一个新的肿瘤抑制miRNA，与其呈现负相关的蛋白Akt3，与mTOR通路上的AKT属本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种mir‑505双等位基因敲除的方法，包括：(1)将pIRES‑neo2载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到pIRES‑neo2载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo‑Xho I载体的Nru I位点，得到neo‑Xho I‑Nru I载体；(2)将pIRES‑neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP‑C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo‑EGFP载体；载体经Xho I酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法将3’同源臂插入到neo‑EGFP载体的Xho I位点；然后载体经Nru I酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法将5’同源臂插入到neo‑EGFP‑Xho I载体的Nru I位点，得到neo‑EGFP‑Xho I‑Nru I载体；(3)将CRISPR/Cas系统载体和neo‑Xho I‑Nru I载体共同转染哺乳动物细胞，将mir‑505基因被外源neo基因替换，通过G418抗性筛选得到mir‑505单等位基因敲除细胞；再一次将CRISPR/Cas系统载体和neo‑EGFP‑Xho I‑Nru I载体共同转染mir‑505单等位基因敲除细胞，将另一条mir‑505基因被外源EGFP和neo基因替换，挑选得到表达绿色荧光蛋白的细胞即mir‑505双等位基因敲除细胞。...
【技术特征摘要】
1.一种mir-505双等位基因敲除的方法，包括：(1)将pIRES-neo2载体经XhoI酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到pIRES-neo2载体的XhoI位点；然后载体经NruI酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-XhoI载体的NruI位点，得到neo-XhoI-NruI载体；(2)将pIRES-neo2载体在克隆位点双酶切后，将从pEGFP-C1载体上切割下来的EGFP基因插入载体中，得到neo-EGFP载体；载体经XhoI酶切后，将扩增得到的3’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-EGFP载体的XhoI位点；然后载体经NruI酶切后，将扩增得到的5’同源臂，通过同源重组的方法插入到neo-EGFP-XhoI载体的NruI位点，得到neo-EGFP-XhoI-NruI载体；其中，步骤(1)和(2)扩增得到3’同源臂的引物为：EGFP-505-R-F：CCAGCTGGGGCTCGAGGGAGCATCGCCAAGTTCG；EGFP-505-R–R：CTAGAATGCACTCGAGGCCAGTGCCTCCTTCTGA；步骤(1)扩增得到5’同源臂的引物为：EGFP-505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAACGCTTGCGGATGTGATT；EGFP-505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGATTGGTCCTTGGCTGGTGT；步骤(2)扩增得到5’同源臂的引物为：505-L-F：TTTTGCGCTGCTTCGCGAAAGAGGGTGAATGCATGGGA；505-L–R：CTGGCCCGTACATCGCGACTGGAAGCTTGCACATGGTT；步骤(1)和(2)中的3’同源臂具体为：以HEK293A细胞基因组DNA为模板，利用HotstartTaq酶特异性扩增得到的858bpmi...
【专利技术属性】
技术研发人员：周宇荀，邓倩云，常雪莹，王斯佳，肖君华，李凯，
申请(专利权)人：东华大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。