检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒，属于生物技术领域。本发明专利技术在高度复合的扩增体系中可以扩增检测8个21号染色体、6个18号染色体、6个13号染色体和3个X染色体相关的STR位点，同时扩增检测4个性别位点。且通过定量荧光PCR(QF-PCR)技术扩增上述所有位点，对21、18、13、X和Y染色体非整倍体数目异常进行检测。本发明专利技术试剂盒，检测周期短，获得样本后5小时就可以可得到结果，灵敏度高，每次检测只需纳克级别的DNA，相当于100个细胞所含的DNA量，因此需要的样本量少，需要1-2ml的羊水即可满足需求。由于灵敏度较高，三体细胞占10％以上的嵌合体就可以被检出。

【技术实现步骤摘要】
检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物及快速检测试剂盒
本专利技术涉及生物技术检测领域，是一种DNA水平的基于定量荧光PCR(QuantitiveFluoresentPCR，QF-PCR)的检测方法，可以对常见的21、18、13三体综合征以及X、Y性别染色体数目异常进行快速、简便、准确的检测。
技术介绍
染色体数目异常和结构畸变是导致出生缺陷的重要原因之一(GardnerRJM,SutherlandGR.Chromosomeabnormalitiesandgeneticcounseling[M].NewYork:OxfordUniversityPress,1996:300-320.)，染色体非整倍体疾病属于染色体数目异常，包括单体型、三体型、多体型和嵌合体。临床上常见包括21三体综合征(Down’ssyndrome)、18三体综合征(Edwardsyndrome)、13三体综合征(Patausyndrome)、以及一些性染色体畸变，如Klinefelter综合征(47,XXY)和Turner综合征(45,X)等。研究表明13、18、21及X/Y染色体异常占新生儿染色体数目异常的95％，这给家庭的社会造成沉重负担。由于至今还没有有效预防和治疗方法，因此，在产前及时诊断21号染色体异常并终止妊娠对降低出生缺陷、提高人口素质有重要意义。目前，临床上以染色体核型分析为诊断金标准，然而该技术有很大局限性。首先要进行羊膜穿刺取羊水，然后培养羊水中胎儿细胞，再进行核型分析。整个周期需要2-3周，操作复杂，需要有经验的检测人员操作。另外近几年应用的技术为荧光原位杂交(FISH)，这一方法较核型分析速度稍快，不需细胞培养，利用已知核酸序列作为探针，以荧光素直接标记或以非放射性物质标记后与靶DNA进行杂交。再通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物，最后在荧光显微镜下观察杂交信号从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析。这两种方法都具有成本较高，周期长，对操作人员要求较高的特点，同时结果为图片，需要人工判读或干预，难以实现自动化和高通量分析。QF-PCR技术是，通过荧光引物对样本DNA的不同区域进行PCR扩增(因此荧光信号变量与扩增产物变量成正比)，随后采用高分辨率胶电泳(如用于测序的毛细管电泳)对扩增片断进行分离，通过荧光检测系统确定扩增片断的长度并实现对多态位点的分型，通过扫描软件对预期大小的扩增产物对应的峰面积定量，实现对原始模板量的定量。定量荧光PCR体系(QuantitativeFluorescentPCR，QF-PCR)中同时扩增多个21、18、13、X和Y染色体上的短串联重复序列(ShortTandemRepeats，STR)基因座，利用STR基因座的多态性来判断染色体数目。非整倍体数目异常是由染色体数目增多或减少一条引起的疾病，因此对染色体上的STR位点经过QF-PCR扩增、检测会得到1:1:1的三个峰、2:1的两个峰或一个峰，其中前两种情况是三体综合征样本相对于正常样本所特有的。STR位点多态性越高则出现单一峰的几率越小，出现前两种情况比例越大。对多个特定染色体上的STR位点进行检测，综合考量各个位点峰数量和峰面积即可判定检测样本是否为三体综合征。1993年Mansfield首次报道应用STR(ShortTandemRepeats，短串联重复序列)进行QF-PCR，成功检测21三体综合征(Mansfield，DiagnosisofDownsyndromeandotheraneuploidiesusingquantitativePCRandsmalltandemrepeatpolymorphisms.HumMolGenet.1993；2:43–50.)。此后越来越多的研究者采用STR基因座联合检测的方法来诊断。如：专利200510025466.8，分子生物学法三体检测试剂盒，通过七个QF-PCR体系检测3个21号染色体、2个18号染色体和2个13号染色体STR位点；专利200410021619.7，一种生物非整倍体的检测方法，每条染色体选用6-9个STR位点，一个体系包含3-4个同一染色体STR位点；专利201310555078.5，一种单管复合扩增检测人类五条染色体非整倍体的试剂盒，通过1个QF-PCR体系检测23个位点，包括6个21号染色体的STR位点，5个18号染色体的STR位点，4个13号染色体的STR位点和8个性染色体位点。上述专利往往采用的STR位点不合理或数目较少，且每个QF-PCR扩增体系中包含的位点数量少，导致检测效率和准确性不够高。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供染色体非整倍体数目异常的检测PCR扩增组合物，在高度复合的扩增体系中可以扩增检测8个21号染色体、6个18号染色体、6个13号染色体和3个X染色体相关的STR位点，同时扩增检测4个性别位点。且通过定量荧光PCR(QF-PCR)技术扩增上述所有位点，对21、18、13、X和Y染色体非整倍体数目异常进行检测。本专利技术的另一个目的在于提供一种非整倍体数目异常检测试剂盒。该试剂盒利用多重定量荧光PCR扩增体系，通过该试剂盒可实现仅以一个扩增检测反应完成对样品简便、稳定、准确、精细和高效地检测。检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括27对引物，可同时扩增23个与21、18、13、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和4个Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点：D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、D21S1246、XHPRT、D13S325和PentaD，所述引物分别为：扩增D13S256的引物：引物1：AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAG，引物2：TACTTATAAGCAGAGAGACATAA；扩增D13S797的引物：引物1：TTTTGGTTTGCTGGCATCTG，引物2：TTGTCTGGAGGCTTTTCAGTC；扩增DXS6809的引物：引物1：TGTTTCCATCTTTCTCTGAAC，引物2：GAATCCAATTTTGCTTTAGGC；扩增DXS9895的引物：引物1：CCATGATTCAAATTATCTCCCACC，引物2：CCATCATTTGCCTTGAGAAAA；扩增D21S2052的引物：引物1：ACTGTACAGAGGTTCTCCGGGCA，引物2：CATGTCTTGAGCCTTCCAGCTCTCT；扩增D18S51的引物：引物1：TTCACTCTGAGTGACAAATTGA，引物2：CATTAAGCTCACTTTAGCCG；扩增AMEL的引物：引物1：CACCAGCCAAACCTCCCTCCGC，引物2：GCTGCATGGGGTGCACAGGTG；扩增D18S535的引物：引物1：ACAAAAGCCACACCCATAAC，引物2：GAAATATAGA本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括27对引物，可同时扩增23个与21、18、13、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和4个Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点：D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、D21S1246、XHPRT、D13S325和Penta D，所述引物分别为：扩增D13S256的引物：引物1：AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAG，引物2：TACTTATAAGCAGAGAGACATAA；扩增D13S797的引物：引物1：TTTTGGTTTGCTGGCATCTG，引物2：TTGTCTGGAGGCTTTTCAGTC；扩增DXS6809的引物：引物1：TGTTTCCATCTTTCTCTGAAC，引物2：GAATCCAATTTTGCTTTAGGC；扩增DXS9895的引物：引物1：CCATGATTCAAATTATCTCCCACC，引物2：CCATCATTTGCCTTGAGAAAA；扩增D21S2052的引物：引物1：ACTGTACAGAGGTTCTCCGGGCA，引物2：CATGTCTTGAGCCTTCCAGCTCTCT；扩增D18S51的引物：引物1：TTCACTCTGAGTGACAAATTGA，引物2：CATTAAGCTCACTTTAGCCG；扩增AMEL的引物：引物1：CACCAGCCAAACCTCCCTCCGC，引物2：GCTGCATGGGGTGCACAGGTG；扩增D18S535的引物：引物1：ACAAAAGCCACACCCATAAC，引物2：GAAATATAGATGAGAATGCAGAGA；扩增D13S317的引物：引物1：TATCACAGAAGTCTGGGATG，引物2：AAAAAGACAGACAGAAAGAT；扩增D21S1411的引物：引物1：AATATGATGAATGCATAGATGG，引物2：CCCACTCCCAGCCTTCTAAATAT；扩增D18S1002的引物：引物1：AGGAAGCTATCTATACAAAGAGTG，引物2：AAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG；扩增D21S1446的引物：引物1：TATTGCCTAGTGATGTTGTAGCC，引物2：AGAATATGTCCCAAAGGACCTGC；扩增D13S305的引物：引物1：CCTGTTTGAGGACCTGTCGTTA，引物2：TCGAAATCCTAGGCTTGAGTAA；扩增TAF9L的引物：引物1：TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCA，引物2：CTACAGCATCTCTGTTAAATTTAGA；扩增D18S877的引物：引物1：ATAGATGATAGAGATGACACATGA，引物2：TTTCTTCATACATGCTTTATCATGC；扩增LFG21的引物：引物1：AATCATGACACTAATTTTGG，引物2：AGTTCAGGGAAGCCTCAAGG；扩增ZFXY的引物：引物1：TGGACTCAGATGTAACTGAAGAAGT，引物2：TACCAATACTTCTTCTGAAACTACG；扩增D18S851的引物：引物1：TCTCTCTGTCCTCTAGGCTCATTTAGC，引物2：TGAGATAGTTTAAATAGTTTGCC；扩增D21S1435的引物：引物1：CTCAGCACATTCTCCTCTAGATTTA，引物2：AAAGCAAGAGATTTCAGTGCCATC；扩增SRY的引物：引物1：TTCCTTTGCACTGAAAGCTGTA，引物2：TGTCCAGTTGCACTTCGCTGC；扩增D21S11的引物：引物1：ACTTCTGGAGATGGAACACTTTT，引物2：TTGTATTAGTCAATGTTCTCCAGAG；扩增D18S391的引物：引物1：TTGAGGAAGAGAGAAATAGAGAGA，引物2：CTATTCCCATCTGAGTCACTCAGC；扩增D13S800的引物：引物1：AGGTAGGTAGGTAAATAGCTAGAT，引物2：ACTGGCTTTCCTCTTCCTTCCTTA；扩增D21S1246的引物：引物1：AAAGTAGACAGGTAAACATACA，引物2：TCATCCATCCATCCACCTATCT；扩增XHPRT的引物：引物1：TTGAGGTATACTTTTCTCTCCAGAAT，引物2：TAAT...

【技术特征摘要】
1.检测染色体非整倍体数目异常的扩增组合物，其特征在于：所述扩增组合物中包括27对引物，可同时扩增23个与21、18、13、X染色体非整倍体数目异常检测相关的STR位点和4个Y染色体非整倍体数目异常检测相关位点：D13S256、D13S797、DXS6809、DXS9895、D21S2052、D18S51、AMEL、D18S535、D13S317、D21S1411、D18S1002、D21S1446、D13S305、TAF9L、D18S877、LFG21、ZFXY、D18S851、D21S1435、SRY、D21S11、D18S391、D13S800、D21S1246、XHPRT、D13S325和PentaD，所述引物分别为：扩增D13S256的引物：引物1：AAGAGCAAAACTCCATCTCGATAG，引物2：TACTTATAAGCAGAGAGACATAA；扩增D13S797的引物：引物1：TTTTGGTTTGCTGGCATCTG，引物2：TTGTCTGGAGGCTTTTCAGTC；扩增DXS6809的引物：引物1：TGTTTCCATCTTTCTCTGAAC，引物2：GAATCCAATTTTGCTTTAGGC；扩增DXS9895的引物：引物1：CCATGATTCAAATTATCTCCCACC，引物2：CCATCATTTGCCTTGAGAAAA；扩增D21S2052的引物：引物1：ACTGTACAGAGGTTCTCCGGGCA，引物2：CATGTCTTGAGCCTTCCAGCTCTCT；扩增D18S51的引物：引物1：TTCACTCTGAGTGACAAATTGA，引物2：CATTAAGCTCACTTTAGCCG；扩增AMEL的引物：引物1：CACCAGCCAAACCTCCCTCCGC，引物2：GCTGCATGGGGTGCACAGGTG；扩增D18S535的引物：引物1：ACAAAAGCCACACCCATAAC，引物2：GAAATATAGATGAGAATGCAGAGA；扩增D13S317的引物：引物1：TATCACAGAAGTCTGGGATG，引物2：AAAAAGACAGACAGAAAGAT；扩增D21S1411的引物：引物1：AATATGATGAATGCATAGATGG，引物2：CCCACTCCCAGCCTTCTAAATAT；扩增D18S1002的引物：引物1：AGGAAGCTATCTATACAAAGAGTG，引物2：AAGATGTGAGTGTGCTTTTCAGGAG；扩增D21S1446的引物：引物1：TATTGCCTAGTGATGTTGTAGCC，引物2：AGAATATGTCCCAAAGGACCTGC；扩增D13S305的引物：引物1：CCTGTTTGAGGACCTGTCGTTA，引物2：TCGAAATCCTAGGCTTGAGTAA；扩增TAF9L的引物：引物1：TTTGACAGGTAGTTTTGGGTCA，引物2：CTACAGCATCTCTGTTAAATTTAGA；扩增D18S877的引物：引物1：ATAGATGATAGAGATGACACATGA，引物2：TTTCTTCATACATGCTTTATCATGC；扩增LFG21的引物：引...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晔，宋欣欣，张晓娜，吕悦心，陈初光，
申请(专利权)人：北京阅微基因技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11