一种石油降解菌P‑6及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种石油降解菌P‑6，该菌已于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9913。该菌P‑6以沙特原油为唯一碳源和能源筛选得到，菌株P‑6呈杆状，革兰氏染色结果呈阴性。本发明专利技术的石油降解菌P‑6在最适温度20℃和最佳pH7.0的条件下在降解反应18天后对原油的去除率达到71.4％，原油降解率极高，且菌株耐受性好，在原油浓度高达15g/L时依然能够生长繁殖，具有很大的应用前景，可以应用于石油的降解、生物修复去除环境中的原油污染物、生物修复原油污染土壤和污染地下水等领域。

【技术实现步骤摘要】
一种石油降解菌P-6及其应用
本专利技术具体涉及一种石油降解菌P-6及其应用。
技术介绍
在原油的开采、运输、储存、炼制和使用过程中，大量原油及其衍生产品不可避免地进入环境，对河流、土壤、地下水以及海洋等环境造成严重污染。在陆地，原油污染一般由输油管道破裂、储油罐渗漏等造成；在海洋中，沿海工业尤其是炼油厂的排放以及各类溢油事故是原油污染的重要来源。据不完全统计，全世界平均每年有600-1000万吨原油通过各种途径进入环境(王连生，1994)，之后通过机械作用、物理化学作用和生物作用等扩散至污染点以外的更大范围。原油的化学组成复杂，包括烷烃、环烷烃、芳香烃等多种有毒物质，其中一些化合物如多环芳烃具有潜在或被证实的致癌变、致突变和致畸变作用，并能通过食物链在动植物及人体内富集，对生态环境和人类健康造成巨大威胁。近年来，采用生物修复技术去除环境中的原油污染物已成为国内外学者的热点之一，该技术具有经济高效、环境友好，不产生二次污染的特点，较之传统的物理、化学修复法具有明显优势。生物修复技术的关键是筛选出能够高效降解目标污染物的微生物。原油中包含了以稠环芳香烃为代表的多种难降解有机物，生物可利用性低，已有降解微生物对原油的降解能力存在很大差异。信艳娟等分离出一株原油降解菌Nitratireductorbasaltis，14d内对原油(初始浓度为1g/L)的平均降解率为63.5％。(信艳娟，刘亚男，吴佩春，曹旭鹏，薛松，一株原油降解菌的分离鉴定及降解特性研究，微生物学通报，2013，40(4)：558-566.)袁红莉等筛选出的原油降解菌Corynebacteriumptr13，对原油(0.05g/L)的7d降解率为41％。(袁红莉，杨金水，王占生，李宝珍，仉磊，林壬子，降解石油微生物菌种的筛选及降解特性，中国环境科学，2003，23(2)：157-161.)冯晋阳和吴小宁从长期被石油污染土壤中驯化得到的Microbacterium菌属原油降解菌SY1，虽然SY1对原油的5d降解率为66.1％，但是降解体系中原油的初始浓度仅为0.5g/L。(冯晋阳，吴小宁，高效原油降解菌的筛选及其在生物活性炭中的应用，环境污染与防治，2011，33(6)：39-43.)因此，有必要进一步筛选高效原油降解菌，研究其降解特性，为原油污染环境的生物治理提供菌株和基因材料。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术的目的在于提供一种石油降解菌P-6，该菌已于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9913。本专利技术的另一个目的在于提供上述石油降解菌P-6的应用。为实现上述技术目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种石油降解菌P-6，其分类命名为微杆菌Microbacteriumsp.P-6，已于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，登记入册编号为CGMCCNo.9913。所述石油降解菌P-6以沙特原油为唯一碳源和能源筛选得到，菌株P-6呈杆状，革兰氏染色结果呈阴性。菌株P-6能够在温度15-35℃，pH5-9的范围内以原油为唯一碳源进行生长繁殖。菌株P-6在NCBI的GenBank数据库中的序列登录号为HM107776。该细菌与微杆细菌聚在一群，其中，P-6与Microbacteriumsp.Sq(NCBI登录号EU293209)同源性最高，达100％。用MEGA4.1计算出序列的系统进化距离，采用邻位相连法构建系统进化树，将菌株P-6鉴定为Microbacteriumsp.P-6。本菌株于2009年9月筛选得到，筛选方法如下：原油污染土样：某加油站储油管道长期滴漏部分下方地表以下0.5m～1m处的被污染土壤。原油：来自中石化加油站提供的沙特原油。富集培养基：牛肉膏0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl0.5％，pH7.0～7.2。配制固体培养基时添加2.0％的琼脂。无机盐基础培养基(mineralsaltmedium，MSM)(L-1)：100mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，0.0675gMgSO4，0.0364gCaCl2，1.0mLFeCl3溶液(0.25g·L-1)，1.0mL微量元素溶液[Mn2SO439.9mg，ZnSO4·H2O42.8mg，(NH4)6Mo7O24·4H2O34.7mg，水1.0L]，pH7.0。原油选择培养基：在无机盐基础培养基中加入一定量的原油。为了使原油在MSM中分布均匀，采用带棉塞的灭菌锥形瓶蒸发含有目标浓度原油的石油醚，使得原油在玻璃器皿壁上形成一薄层，在无菌条件下加入MSM，30℃恒温水浴超声，直至形成乳浊液。原油固体选择培养基：在55℃的恒温水浴条件下，将液态原油选择培养基与熔化的琼脂溶液相混合。使用双层琼脂技术，将混合液倾倒至已事先制备好的MSM固态培养基上。以上培养基使用前均在0.1MPa，121℃，灭菌30min。筛选步骤：称取10g原油污染土样于200mL无菌去离子水中溶解振荡，静置1d，取上清液接入原油选择培养基中，接种量5％，原油浓度1000mg/L。30℃、120rpm下连续培养7d。取5％培养液接入原油浓度为1200mg/L的原油选择培养基中，继续30℃、130rpm下连续培养7d，重复上述步骤连续培养5次，每次原油浓度递增100mg/L。吸取经多次驯化后的培养液涂布于原油固体选择培养基平板上，待菌落长好后，选择生长良好，菌苔较大且形态特征各异的菌落，于富集培养基固体平板上划线分离、纯化。连续多次划线纯化后，得到不同形态特征且生长良好的菌株，进一步接种至原油选择培养基中测定其原油降解能力，最后获得一株高效原油降解菌P-6。本专利技术同时提出了上述石油降解菌P-6在降解石油中的应用。本专利技术进一步提出了上述石油降解菌P-6在生物修复去除环境中的原油污染物中的应用。本专利技术还提出了上述石油降解菌P-6在生物修复原油污染土壤和污染地下水中的应用。有益效果：研究结果表明，本专利技术提出的石油降解菌P-6在最适温度20℃和最佳pH7.0的条件下在降解反应18天后对原油的去除率达到71.4％，原油降解率极高，且菌株耐受性好，在原油浓度高达15g/L时依然能够生长繁殖，具有很大的应用前景。附图说明图1为不同温度下菌株对原油的降解示意图；图2为不同pH下菌株对原油的降解示意图；图3为原油的降解率曲线；图4为菌株P-6的16SrDNA扩增检验；图5为16SrDNA序列同源性的菌株间的系统发育树；图6为菌株P-6的对不同初始原油浓度的7d降解率。具体实施方式根据下述实施例可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解的是，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。下述实施例中采用的胰化蛋白胨、酵母膏和琼脂糖，均为试剂纯，购自BIOBASICINC，加拿大；细菌基因组DNA抽提试剂盒、TaqDNAPolymerase、dNTPs、引物27F、引物1492R以及PCR纯化试剂盒，均购自天根生化科技有限公司。实施例1石油降解菌P.6的分离、纯化及鉴定。(一)培养基的配制：富集培养基：牛肉膏0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石油降解菌P‑6，其分类命名为微杆菌Microbacterium sp.P‑6，已于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9913。

【技术特征摘要】
1.一种石油降解菌P-6，其分类命名为微杆菌Microbacteriumsp.P-6，已于2014年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.9913，所述石油降解菌P-6的最适温度为20℃，最佳pH7.0。2.权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐红霞，吴吉春，施小清，孙媛媛，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32