一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用技术

一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用。首先筛选出高效氨氧化细菌，对其进行耐盐和耐冷性驯化得到被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp，再将制备好的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中对生物炭球挂膜后与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液混合，最后将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液后放置冰箱交联、清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。显然本发明专利技术利用生物炭球为载体固定化耐盐耐冷氨氧化细菌，载体材料因地制宜来源广泛，制法简单，易于产业化，耐盐耐冷氨氧化细菌固定化的生物炭球应用于低温高盐的氨氮污染水体净化，微生物量大，机械强度高，处理效果好，费用低，无需回收，且对环境也不会造成二次污染。

【技术实现步骤摘要】
一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用
本专利技术属于水污染治理技术，具体涉及一种耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法和应用，是耐盐耐冷氨氧化细菌的驯化与筛选及其固定化方法与应用。
技术介绍
氨氮过高是水体富营养化的主要因素之一，是水污染控制的主要指标。目前国内外针对氨氮的去除方法主要包括物理方法、化学方法和生物方法。物理方法只能实现污染物在空间上的位移，不能实现彻底的去除；化学方法快速有效，但由于引进化学药剂，处理不当会对水体构成二次污染；生物方法利用微生物的代谢将氨氮转化为氮气，实现污染物的去除，同时不会对环境构成二次污染而被广泛的认可。已有处理氨氮废水的方法(ZL102001721A)的专利，是在微波场辐照氨氮废水和活性炭的混合液进行脱除氨氮，虽然去除效率高，但只改变了氨氮的存在形态，没有彻底去除，并且该方法不适用于自然地表水体。研究表明，利用微生物降解水体中的氨氮受到诸如盐度、温度等环境条件的影响，造成降解效率的降低。河口湿地水体中盐度介于淡水和海水之间，高于10‰，被认为是高盐度水体。水体中盐度过高会破坏微生物细胞的渗透压，破坏微生物的酶系统。同时，低温环境会影响微生物酶的活性和繁殖速率，抑制对氨氮的去除。目前文献报道氨氧化细菌的最适生长温度为30℃-35℃，对于北方寒冷地区，特别是诸如辽河湿地这样的面积广阔的自然湿地，低温条件不利于氨氧化细菌对氨氮的降解。目前已有专利(ZL102268386A)筛选出一株降解效果好的氨氧化细菌，在温度为30℃的实验室培养条件下该菌株的氨氧化效率可达90％，显然该方法筛选出的氨氧化细菌的最佳温度高，不能在低温环境产生较好的去除效果；即使有耐低温的细菌也往往也无法同时适应高盐度环境。另外，高效菌剂在自然水体中的投加也是一个十分重要的问题。通常的通过培养驯化获得的高效菌剂投加在固定容积的反应器中，虽然通过改变反应器内的条件能够获得较好的降解效果，但应用于现场流动态的自然河流中，随着水体的流动，菌剂在水体中冲散，难以保证足够的停留时间和足够的微生物浓度，因此不能实现较好的去除效果。加上东北地区的辽河湿地为重要的石油开采区，石油的开采、运输和储存造成的石油泄漏，对微生物构成毒害作用，又大大的制约了对氨氮的降解。显然提供一种耐盐耐冷氨氧化细菌的驯化与筛选及其固定化方法是物态环境的急备所需。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷脱氮菌固定化方法，以克服现有技术存在的问题。本专利技术首先考虑到位于我国北方的辽河口湿地，常年处于低温状态，与此同时，河口湿地生态系统是一个咸淡水交汇，盐度偏高，生态环境敏感的复杂生态系统。然而，利用已有的传统物理、化学和生物方法无法达到较好的修复效果，且治理成本高。所以专门从湿地的沉积物中筛选、驯化的耐盐耐冷氨氧化细菌处理辽河水体中的氨氮，不但处理效果好、费用低，而且因地制宜，不但不会对原有的生态环境构成威胁，而且能充分利用本地资源降低成本。又考虑到在流动态的自然河流中，为了保持降解菌在水体中足够的停留时间和足够的微生物浓度，以实现高效的去除效果，解决在现场自然水体中的投加的重要问题。首次提出以生物炭球为载体的脱氮菌固定化技术，在能够保证微生物不被水流冲散和单位体积的微生物量的同时，对耐盐耐冷氨氧化细菌具有保护作用，实现氨氮的高效去除。因此，本专利技术首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将将制得的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。上述的高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：(1)富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于上述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH4)2SO45.5g，CaCO35.5g，NaCl2.0g，MgSO40.5g，K2HPO41.5g，MnSO40.01g，FeSO40.02g，蒸馏水1000mL，5％Na2CO3调节pH＝8.0，121℃灭菌30min。(2)纯化分离：将上述氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，分别涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌。上述的固体培养基：NH4SO42g，NaH2PO40.25g，MgSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.01g，K2HPO40.75g，NaCl0.01g，CaCO35g，琼脂20g蒸馏水1000mL，5％Na2CO3调节pH＝7.2，121℃灭菌30min。上述的氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：(1)耐盐性驯化：将上述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液。待上述各单菌株富集液进入对数增长期时，以各单菌株富集液与富集培养基5％的接种量依次接种于另外的100mL盐度为5‰、10‰、15‰和20‰的富集培养基中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐氨氧化细菌；(2)耐冷性驯化：将上述筛选出的耐盐氨氧化细菌以富集液与富集培养基5％的接种量接种到一个100mL盐度为20‰的富集培养基中，依次于25℃、20℃、15℃和10℃，150r/min-180r/min的条件下震荡培养数天，筛选出对氨氮降解效果好的氨氧化细菌即为耐盐耐冷氨氧化细菌。上述所述生物炭球挂膜方法：将生物炭球置于上述耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中浸泡4-6天，得到挂膜生物炭球。上述耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球：将上述挂膜生物炭球与包埋混合液混合，然后逐粒放入饱和硼酸溶液，放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球，上述的包埋混合液是10％聚乙烯醇的水溶液和20％的湿菌体按体积(10-15)：1的比例混合得到的。上述湿菌体是取50ml-100ml的微生物富集液经5000-8000r/min离心10-15min,去除上清液后用无菌水清洗多次后得到的。上述的耐盐耐冷氨氧化细菌为已被驯化的Ochrobactrum.sp和Aquamicrobium.sp。上述的生物炭球的制备方法，包括如下步骤：(1)取秸秆洗净，烘干至恒重，将秸秆粉碎过筛得到秸秆粉末，经过马弗炉烧制成生物炭；(2)将上述烧制的生物炭用去离子水清洗若干次，并利用0.1mol/L的硝酸作为改性剂，在200r/min的磁力搅拌条件下，使上述改性剂与生物炭充分混匀，进行改性一天后，再用去离子水清洗至pH为中性得本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将制得的生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将上述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球。

【技术特征摘要】
1.一种以生物炭球为载体的耐盐耐冷氨氧化细菌固定化方法，其特征是首先筛选出高效氨氧化细菌，然后对氨氧化细菌进行耐盐和耐冷性驯化得到耐盐耐冷氨氧化细菌，其次将制得的数个生物炭球置于耐盐耐冷氨氧化细菌富集液中得到挂膜生物炭球，再将所述挂膜生物炭球置于与耐盐耐冷氨氧化细菌包埋混合液中并从中取出再逐粒放入饱和硼酸溶液中，最后，将混合液中的生物炭球逐粒放入饱和硼酸溶液中，并放置冰箱4℃交联12h，交联完成后用无菌水清洗，得到耐盐耐冷氨氧化细菌固定化生物炭球；上述高效氨氧化细菌的筛选方法，包括如下步骤：（1）富集培养：称取干重10g-20g的沉积物，加入到一个盛有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中，于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天后吸取10mL至另一个富集培养基中，于所述条件震荡培养数天，如此重复上述步骤3次以提高氨氧化细菌的浓度，最终得到氨氧化细菌富集液；上述富集培养基为：(NH4)2SO45.5g，CaCO35.5g，NaCl2.0g，MgSO40.5g，K2HPO41.5g，MnSO40.01g，FeSO40.02g，蒸馏水1000mL，5%Na2CO3调节pH=8.0，121℃灭菌30min；（2）纯化分离：将所述氨氧化菌富集液按10-1-10-7梯度进行稀释，涂布在固体培养基上，于28℃-30℃培养数天，待菌落长成后，挑选不同形态的菌落在另一个固体培养基上进行反复划线，直到生成的菌落为不同种单一形态的单一菌，分离得到多株纯种氨氧化细菌，上述培养基为：NH4SO42g，NaH2PO40.25g，MgSO4·7H2O0.03g，MnSO4·4H2O0.01g，K2HPO40.75g，NaCl0.01g，CaCO35g，琼脂20g蒸馏水1000mL，5%Na2CO3调节pH=7.2，121℃灭菌30min；上述氨氧化细菌的耐盐和耐冷性驯化方法，包括如下步骤：（1）耐盐性驯化：将所述分离得到多株纯种氨氧化细菌挑取到一个富集培养基中于150r/min-200r/min，28℃-30℃的条件下震荡培养数天，分别得到单菌株富集液，待所述各单菌株富集液进入对...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄潇，李岿然，党佳佳，李辉，赵阳国，白洁，张颖，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：山东;37