一种双功能配体靶向树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗及其制备方法，该方法包括以下步骤：S1、制备甘露糖修饰的纳米脂质体；S2、将CpG-ODN连接至纳米脂质体上得到双功能配体修饰的纳米脂质体；S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取出肿瘤抗原肽；S4、通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内。本发明专利技术采用双功能配体修饰的纳米脂质体作为载体，脂质体表面的甘露糖分子能特异性靶向至树突状细胞，CpG-ODN则结合于树突状细胞内的Toll样受体9，促进树突状细胞成熟，成熟的树突状细胞能高效递呈纳米脂质体内部释放出的肿瘤抗原肽，激活T淋巴细胞，产生特异性抗肿瘤作用。

【技术实现步骤摘要】
一种双功能配体靶向树突状细胞肿瘤疫苗及其制备方法
本专利技术属于生物材料的医学基础应用领域，更具体地说，涉及一种双功能配体靶向树突状细胞（DC）肿瘤疫苗及其制备方法。
技术介绍
肿瘤是严重危害人类健康的重大疾病之一。虽然传统方法如手术切除、局部或全身化疗和放疗等方法取得了一定的进展，但是仍然需要探索新的抗肿瘤方法。树突状细胞（DC）是目前研究已知的体内能力最强的专职抗原提呈细胞（APC），也是唯一能诱导初次免疫应答和激活未致敏T细胞的APC。DC作为抗原特异性免疫应答的始动者，在机体的抗肿瘤免疫反应中发挥着核心的作用。肿瘤浸润组织中DC诱导免疫效应细胞的能力较低，这是因为在肿瘤的发生发展过程中，DC的成熟不仅受到肿瘤细胞死亡方式的影响，而且坏死的肿瘤细胞核晚期凋亡的肿瘤细胞仅给DC输送了部分成熟信号，肿瘤细胞产生的可溶性因子也会对DC的成熟和功能起到抑制作用。探索新的方法靶向有效激活体内的抗原提呈细胞产生抗肿瘤效应有重要的科学意义和潜在的应用前景。肿瘤的免疫治疗是近年来兴起的最有前景的治疗方法，其最大的优点处在于激发、增强机体的特异性免疫反应，加强免疫系统的自我调节能力，从而达到延缓和降低肿瘤复发转移的目的。肿瘤主动性免疫治疗是指利用肿瘤细胞或肿瘤特异性抗原物质或者免疫佐剂等诱导机体产生特异性免疫，进而主动杀伤肿瘤细胞。但是输注进体内的肿瘤抗原肽或者佐剂缺乏靶向性和免疫原性弱等问题，无法强有效地刺激机体产生特异性的抗肿瘤作用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题在于，针对现有肿瘤主动免疫治疗中肿瘤抗原肽疫苗靶向性弱、抗原刺激性低下的问题，提供一种双功能配体靶向DC的肿瘤疫苗及其制备方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：提供了一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通过真空旋转蒸发后干燥，再重悬过滤得甘露糖修饰的纳米脂质体；S2、使用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺制备胶束液，将CpG-寡聚脱氧核苷酸溶液加入所述胶束液中，在氮气氛围中反应30-60分钟，加入与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺等摩尔的β-半胱胺，孵育30-60分钟；随后将孵育液加入步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液中，反应30-45分钟，得到双功能配体修饰的纳米脂质体；S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗原肽；S4、通过冻干-再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内得双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。在根据本专利技术所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S1中真空旋转蒸发的转速为200rpm/min，时间为10-20分钟，水浴温度为40度，所述干燥的时间为2-4小时，所述重悬采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液水浴超声5-10分钟，所述过滤中采用孔径为200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜。在根据本专利技术所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S2中将孵育液与步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液在55度水浴反应30-45分钟。在根据本专利技术所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S3中，将型号为H22或4T1的肿瘤细胞的重悬液用封口膜密封，在液氮中反应10-20分钟，再在37℃水浴反应10-20分钟，如此反复冻融，最后在600rpm转速下离心10分钟收集上清得到所述肿瘤混合抗原肽。在根据本专利技术所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S3中反复冻融5次。在根据本专利技术所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法中，所述步骤S4具体包括：在步骤S2制得的双功能配体修饰的纳米脂质体中加入所述肿瘤抗原肽以及与所述双功能配体修饰的纳米脂质体等摩尔的蔗糖，通过冻干-再水化法制备双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。本专利技术还提供了一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗，其采用如上所述的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法制得。实施本专利技术的双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗及其制备方法，具有以下优势与效果：本专利技术采用双功能配体修饰的纳米脂质体作为载体，具有良好的生物相容性和高效的载荷量，将相应的肿瘤抗原肽包裹至载体内，制备得到双功能配体靶向DC的肿瘤疫苗；本专利技术通过适当的制备条件获得的双功能配体脂质体纳米粒子粒径适中，通过皮下注射，能高效靶向并刺激皮下的树突状细胞，由于材料的体积优势及表面修饰的聚乙二醇（PEG），在体内可以降低粒子被网状上皮系统清除速率，延长粒子在体内的停留时间。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法流程图；图2所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的粒径分布图；图3A为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体的扫描电镜图，图3B为甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3C为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹4T1抗原肽纳米粒子的扫描电镜图，3D为链接有CpG-ODN纳米粒子的甘露糖修饰的纳米脂质体包裹H22抗原肽纳米粒子的扫描电镜图；图4所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗刺激树突状细胞成熟流式结果统计图；图5所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗血清稳定结果图；图6所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的肿瘤生长曲线图；图7所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的生存曲线；图8所示为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗治疗荷瘤小鼠的肿瘤照片。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。请参阅图1，为根据本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法流程图。如图1所示，本专利技术的双功能配体靶向DC肿瘤疫苗的制备方法包括以下步骤：首先，在步骤S1中，先制备出甘露糖修饰的纳米脂质体。步骤S1具体包括：S1-1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱（POPC）、胆固醇（cholesterol）、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE）、双十二烷基二甲基溴化铵（DDAB）、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚（α-tocopherol）按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后通过真空旋转蒸发；具体地，本实施例中以制备一份双配体靶向肿瘤疫苗为例，可以称取以下质量的原料：POPC7.56mg、胆固醇3.2mg、DSPE-PEG20002.8mg、DDAB0.38mg、软脂酸-甘露糖酯0.17mg和α-生育酚0.017mg，加入到5ml的圆底烧瓶中，将烧瓶接到旋转蒸发仪上，旋转蒸发仪以转速为200rpm/min旋转并打开真空泵抽真空。待看到圆底烧瓶表面产生一层水汽后，将瓶身降至水浴锅中，水浴锅的温度为40度，旋转10-20min后即可关闭真空并停止旋转，形成A；S1-2、将A置于真空干燥箱中干燥2-4h去除残余的有机溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇2000‑二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵、软脂酸‑甘露糖酯、α‑生育酚按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通过真空旋转蒸发后干燥，再重悬过滤得甘露糖修饰的纳米脂质体；S2、使用磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑马来酰亚胺制备胶束液，将CpG‑寡聚脱氧核苷酸溶液加入所述胶束液中，在氮气氛围中反应30‑60分钟，加入与磷脂酰乙醇胺‑聚乙二醇‑马来酰亚胺等摩尔的β‑半胱胺，孵育30‑60分钟；随后将孵育液加入步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液中，反应30‑45分钟，得到双功能配体修饰的纳米脂质体；S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗原肽；S4、通过冻干‑再水化法将肿瘤抗原肽包裹进所述功能配体修饰的纳米脂质体内得双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种双功能配体靶向树突状细胞的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、胆固醇、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、双十二烷基二甲基溴化铵、软脂酸-甘露糖酯、α-生育酚按照摩尔比为49.8：40：5：3：2：0.2的比例混合后，通过真空旋转蒸发后干燥，再重悬过滤得甘露糖修饰的纳米脂质体；该步骤中真空旋转蒸发的转速为200rpm/min，时间为10-20分钟，水浴温度为40度，所述干燥的时间为2-4小时，所述重悬采用4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液水浴超声5-10分钟，所述过滤中采用孔径为200nm、100nm和50nm的聚碳酸酯膜；S2、使用磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺制备胶束液，将CpG-寡聚脱氧核苷酸溶液加入所述胶束液中，在氮气氛围中反应30-60分钟，加入与磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺等摩尔的β-半胱胺，孵育30-60分钟；随后将孵育液加入步骤S1制得的甘露糖修饰的纳米脂质体的溶液中，反应30-45分钟，得到双功能配体修饰的纳米脂质体；S3、通过反复融冻法从肿瘤细胞中提取肿瘤抗...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢小玲，赵永祥，赖春慧，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西;45