葵花籽过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法技术

本发明专利技术公开了一种葵花籽过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法。本发明专利技术方法基于环介导等温扩增技术，根据葵花籽HaG5基因序列设计6条特异性引物，在具有链置换活性的Bst2.0WarmStarDNA聚合酶作用下，在63～65℃对核酸扩增45～60min，扩增效率可以达到109～1010个拷贝数。该方法具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点。

【技术实现步骤摘要】
葵花籽过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法
本专利技术属于分子生物学技术及食品安全检测领域，涉及食品中过敏原成分的检测方法，具体涉及葵花籽过敏原的恒温扩增检测引物、试剂盒及方法。
技术介绍
葵花籽是菊科向日葵属（Helianthusannuus）草本植物向日葵的种子，可供食用和油用。葵花籽是常见的、广泛食用的坚果，葵花籽引起的过敏反应轻者会引起荨麻疹、唇舌水肿、脸部红肿、流泪、流涕，重者呼吸系统会受到影响引起哮喘、呼吸短促、呼吸困难等症状，有些会出现胃肠道的症状如腹泻、呕吐、腹痛，严重的甚至会引起死亡，因而属于食品过敏原标识管理的重要种类。我国强制性国家标准《GB7718-2011预包装食品标签通则》明确规定了坚果及其果仁类制品应该在预包装食品上予以声明。在此基础上，我国在各级推荐性食品标准中也作出了类似的规定，例如《GB/T23779-2009预包装食品中的致敏原成分》、《DB11/Z521-2008奥运会食品安全食品过敏原标识标注》、《DBJ440100/T28-2009亚运会食品安全食品过敏原标识标注》均对此有明确的规定。食品过敏原标识管理的有效实施，依赖于完善的技术监控手段。其中，食品过敏原检测技术是必不可少的一个组成部分。食品过敏原的检测技术主要分为两类，一类是基于蛋白质的检测方法，一类是基于基因的检测方法。到目前为止，国内外都没有发布过葵花籽过敏原成分的标准检测方法，也尚未建立任何达到行业应用水平的通用方法。这种现状已经严重影响了葵花籽过敏原标识管理规定的科学有效实施。基于蛋白质的检测方法在技术上存在明显的局限性，并不能完全满足食品行业生产管理和监管部门技术监督的需要。基于蛋白质的检测技术局限性表现为：现有研究结果表明食品过敏原中能够引起过敏反应的蛋白质组成复杂，葵花籽中存在的过敏原蛋白质组成尚未完全调查清楚，因此以过敏原蛋白质为检测目标物质建立的蛋白质检测技术得到的检测结果存在与实际致敏效应发生偏差的可能性；基于免疫学原理的蛋白质检测技术对检测样品提取物的背景干扰具有较高的要求，与此同时由于预包装食品种类、配料成分、加工工艺千差万别造成背景干扰非常复杂，极大局限了葵花籽过敏原蛋白质免疫检测方法的实际应用效果。此外，相对于核酸而言，葵花籽过敏原蛋白质容易在食品加工过程中发生变性，对基于免疫学原理的蛋白质检测技术造成不可忽略的性能下降。相比之下，基于基因检测的方法以食品过敏原的特异性基因片段为检测对象，通过食品中是否存在过敏原所属物种的保守基因片段来判断是否含有某种特定的过敏原成分。由于核酸的稳定程度比蛋白质高，在食品加工过程中不易被破坏，因此这类技术可以更加稳定的检测出微量的过敏原成分。现有常用的基因检测方法为实时荧光PCR法，但是该方法需要使用大型的仪器设备、耗时长、对技术要求高、成本昂贵，并不适用于基层实验室的推广应用。环介导恒温基因扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification，以下简称恒温扩增法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，是一种简便、快速、高特异的基因扩增法，不需要昂贵的特殊设备。与实时荧光PCR方法相比成本更为低廉、操作更为简便，更加适合基层实验室推广应用。目前尚未有将LAMP法应用于快速检测葵花籽的试剂盒方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于提供一种葵花籽过敏原的恒温扩增检测方法。本专利技术的另一个目的在于提供一种用于检测葵花籽过敏原的恒温扩增试剂盒。本专利技术的另一个目的在于提供一组用于检测葵花籽过敏原的特异性恒温扩增引物。本专利技术所采取的技术方案是：一种葵花籽过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：1）根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；2）待检样品DNA在上述引物、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在葵花籽过敏原成分。作为优选的，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：外引物1：CTCCAGCAGTGTTGTCAA（SEQIDNo：1）；外引物2：GGATATCGATATTGCTCTCGG（SEQIDNo：2）；内引物1：GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTGAAACATCGAAGGGCAGTG（SEQIDNo：3）；内引物2：GGTTCGCAGCAGACCCAATGAAGGTTGCATACGTTAGG（SEQIDNo：4）；环引物1：TCGGAACACCTGCTTCAC（SEQIDNo：5）；环引物2：TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT（SEQIDNo：6）。步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、内引物1和内引物2各20～60μM、环引物1和环引物2各5～20μM、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶5～10U、pH8.8的Tris-HCl20mM、KCl8～12mM、(NH4)2SO48～12mM、0.08～0.12%Tween-20、dNTPs1.5～1.7mM、MgSO40.6～1.0mM、甜菜碱0.7～0.9M，待检样品DNA2μL。作为优选的，步骤2）所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl20mM、KCl10mM、(NH4)2SO410mM、0.1%Tween-20、dNTPs1.6mM、MgSO40.8mM、甜菜碱0.8M，待检样品DNA2μL。步骤2）所述恒温扩增反应的程序为：63～65℃恒温反应45～60min。步骤3）可采用曲线法或显色法判断扩增结果，曲线法：在反应体系中恒温加入1-20μMSYTO-9使用荧光PCR仪或其它恒温荧光检测仪进行检测，根据扩增曲线判断结果，有“S”型扩增曲线的为阳性，无“S”型扩增曲线的为阴性；显色法：在反应体系中加入500-2000×GeneFinder，根据颜色判断结果，阳性为绿色，阴性为橙色。一种用于检测葵花籽过敏原的恒温扩增试剂盒，其包括6条根据葵花籽HaG5基因序列设计的特异性恒温扩增检测引物。所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：外引物1：CTCCAGCAGTGTTGTCAA（SEQIDNo：1）；外引物2：GGATATCGATATTGCTCTCGG（SEQIDNo：2）；内引物1：GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTGAAACATCGAAGGGCAGTG（SEQIDNo：3）；内引物2：GGTTCGCAGCAGACCCAATGAAGGTTGCATACGTTAGG（SEQIDNo：4）；环引物1：TCGGAACACCTGCTTCAC（SEQIDNo：5）；环引物2：TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT（SEQIDNo：6）。所述试剂盒中还包括以下组分：Bst2.0WarmstarDNA聚合酶、pH8.8的Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、Tween-20、dNTPs、MgSO4、甜菜碱、GeneFinder或SYTO-9、阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为葵花籽标准品或含有葵花籽HaG5基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葵花籽过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：1）根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；2）待检样品DNA在上述引物、Bst 2.0 Warmstar DNA 聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3）根据扩增结果判断待检样品中是否存在葵花籽过敏原成分。

【技术特征摘要】
1.一种葵花籽过敏原的恒温扩增检测方法，包括以下步骤：1)根据葵花籽HaG5基因序列设计特异性恒温扩增检测引物；2)待检样品DNA在上述引物、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶存在的条件下进行恒温扩增反应；3)根据扩增结果判断待检样品中是否存在葵花籽过敏原成分；其特征在于，所述恒温扩增检测引物的序列分别如下所示：外引物1：CTCCAGCAGTGTTGTCAA(SEQIDNo：1)；外引物2：GGATATCGATATTGCTCTCGG(SEQIDNo：2)；内引物1：GTTGCTGTTGTACTTGCTGCTGAAACATCGAAGGGCAGTG(SEQIDNo：3)；内引物2：GGTTCGCAGCAGACCCAATGAAGGTTGCATACGTTAGG(SEQIDNo：4)；环引物1：TCGGAACACCTGCTTCAC(SEQIDNo：5)；环引物2：TTGAAGCAGAAGGCTCAGATT(SEQIDNo：6)。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各2～10μM、内引物1和内引物2各20～60μM、环引物1和环引物2各5～20μM、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶5～10U、pH8.8的Tris-HCl20mM、KCl8～12mM、(NH4)2SO48～12mM、0.08～0.12％Tween-20、dNTPs1.5～1.7mM、MgSO40.6～1.0mM、甜菜碱0.7～0.9M，待检样品DNA2μL。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤2)所述恒温扩增反应的体系为：25μL反应体系中含有外引物1和外引物2各5μM、内引物1和内引物2各40μM、环引物1和环引物2各20μM、Bst2.0WarmstarDNA聚合酶8U、pH8.8的Tris-HCl20mM、KCl10mM、(NH4)2SO410mM、0.1％Tween-20、dNTPs1.6mM、MgSO40.8mM、甜菜碱0.8M，待检样品DNA2μL。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)所述恒温扩增反应的程序为：63～65℃恒温反应45～60min。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)采用曲线法或显色法判...

【专利技术属性】
技术研发人员：高东微，李志勇，刘津，武目涛，陈源树，凌莉，席静，刘青，关丽军，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：广东;44