棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法技术

本发明专利技术属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法。所述方法包括用来源于阿非利加棉BAC文库的BAC克隆57I23在不同棉种中进行BAC-FISH的步骤，可同时明显分辨棉花AD基因组及A、D亚基因组染色体。以该BAC-DNA做探针，杂交信号在棉属5个四倍体中覆盖A亚组全部染色体端部以外的大部分区域，及D亚组全部染色体近中部小部分区域；在陆地棉与E组司笃克氏棉(E1)杂交的异源六倍体杂种AADDEE中，杂交信号与四倍体类似，明显与E亚组(无信号)区分开来，即实现了A、D、E三套亚组染色体的同时鉴别。利用本发明专利技术的BAC克隆采用BAC-FISH方法，可以在棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体。

【技术实现步骤摘要】
棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法
本专利技术属于分子细胞遗传学领域，具体涉及棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法。
技术介绍
荧光原位杂交(FISH)技术能够将DNA序列定位于染色质、染色体或DNA纤维上，是一种有效而精确的分子细胞遗传学方法。植物基因组测序是进行功能基因组研究的需要，遗传距离和物理距离之间的分歧，限制了连锁图在指导基因组序列装配、图位克隆等方面的应用。而细胞遗传学图谱代表的是DNA序列在染色体上的实际位置，是基因组物理图谱的类型之一，因此也是基因组测序及序列装配的基础。通过BAC-FISH将DNA克隆直接定位到染色体上是当前构建覆盖整条染色体或整个基因组的物理图谱主要方法之一。在植物细胞遗传学定位中应用了多种DNA探针，其中以单拷贝DNA序列筛选基因组BAC文库，获得的BAC克隆作为原位杂交探针的BAC-FISH技术，由于其DNA插入片段在100kb以上，用作探针与靶DNA杂交时，增加了与靶序列相遇的机会，信号强度与检出率大大提高，促进了该技术在植物基因组研究中的应用。FISH技术的发展，使得越来越多的FISH标记被开发出来，如各种rDAN、染色体特异BAC克隆等，应用于染色体识别、核型分析、系统进化及亲缘关系分析、异源染色质鉴定和转基因鉴定、基因定位和物理图谱构建等研究领域。棉属多倍体属于异源起源，在AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体，传统细胞学方法是依照核型图像染色体的长短确定，随着FISH技术的逐渐发展，以其供体gDNA为探针的GISH技术可以实现亚基因组组成的识别。棉属富含酚类、多糖等高分子次生化合物，对取材、材料存放及提取操作要求严格，因此gDNA提取与纯化较其它物种复杂很多。尤其是ADE背景的异源多倍体，涉及3个基因组来源，需要2-3个gDNA双色或多色探针方能实现亚组染色体的识别，工作量、技术要求、试剂成本相应提高。而BAC-DNA的提取与纯化规避了上述障碍，可以作为理想的FISH标记。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种在棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的方法。本专利技术首先筛选到鉴别棉花AD基因组及A、D亚基因组染色体的FISH探针。该探针是通过SSR引物Gh216对阿非利加棉BAC文库进行筛选，得到的阳性BAC克隆。引物序列信息：ForwardPrimer:TCCACATTCCCATGCACTACTCReversePrimer:CTAAAACCTTATACATACAAAATGCAGC该引物PCR扩增的片段长度约为90bp，序列为：TCCACATTCCCATGCACTACTCAATTTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTTCTTGCTGCATTTTGTATGTATAAGGTTTTAG。扩增产物经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示。对该BAC克隆进行质粒DNA提取，以BAC-DNA作为探针，对不同棉种体细胞中期染色体进行荧光原位杂交(FISH)，结果表明：该探针在5个四倍体棉种的A亚组全套染色体除两近端部以外的染色体大部分区域有明显信号，在D亚组全套染色体近中部一小部分有信号；当该探针对陆地棉((AD)1)与司笃克氏棉(E1)的6倍体杂种(AADDEE)根尖制片进行杂交时，清楚地把AADD染色体从6倍体染色体中区分开来，实现了A、D、E三套亚组染色体的同时鉴别(图2)。根据本专利技术的具体实施方式，所述BAC-FISH方法包括以下步骤：1)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的沙土中，然后在光照培养箱里28-30℃培养，待根长至1～2cm时，截取根尖用25ppm放线菌酮25℃下处理2h，然后用蒸馏水冲洗，用卡诺固定液固定24h以上，备用；2)酶解：取出固定好的根尖，用蒸馏水冲洗数次，混合酶液(2％纤维素酶+1％果胶酶)处理，37℃，45min；3)制片：用60％乙酸进行压片，保留下好的制片在-80℃冷冻4h以上；取出后，迅速揭掉盖片，80℃烤干，4℃保存备用；4)标记探针：探针的标记采用Dig-NickTranslationMix系统标记，首先碱裂解法提取特异BAC克隆的质粒DNA，参考Roche公司的说明，BAC-DNA1μg左右，加4μLDig-NickTranslationMix,ddH2O定容至20μL，混匀，短暂离心。标记程序为15℃90min，65℃10min，1％琼脂糖检测探针长度(200-500bp)，-20℃保存备用。5)荧光原位杂交：参照王春英等(2001)介绍的方法。地高辛标记的探针在荧光显微镜下观察显示红色；染色体用DAPI衬染在荧光显微镜下观察显示蓝色。6)荧光显微镜观察：用Zeiss荧光显微镜观察荧光信号，用Zeiss-Isis成像系统软件进行荧光原位杂交图像的获取、采集、加工。BAC-FISH技术是一种很好的研究染色体结构和染色体之间进化与亲缘关系的方法，本专利技术可以作为种属间基因组水平的遗传标记，这对研究棉花种内或种间的分化以及棉花基因组进化具有重要作用，同时对于棉花的遗传进化研究和棉花育种也具有重要意义，本专利技术也可以用于涉及AD基因组的棉花远缘杂交育种的基因组检测。附图说明图1扩增产物8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果，其中，条带显示的即是基于Gh216-90bpSSR标记筛选阿非利加棉BAC文库得到的能够扩增出目的片段的阳性克隆57I23；图2以BAC克隆57I23为探针(红色)，分别在a:陆地棉(AD)1、b:海岛棉(AD)2、c:毛棉(AD)3、d:黄褐棉(AD)4、e:达尔文氏棉(AD)5，f:六倍体杂种(AADDEE)及g:二倍体A组草棉A1、h:D组瑟伯氏棉D1体细胞中期染色体制片进行FISH的结果，以BAC克隆57I23为探针(红色)，与陆地棉(a)、海岛棉(b)、毛棉(c)、黄褐棉(d)、达尔文氏棉(e)，六倍体杂种(AADDEE)(f)及二倍体草棉A1(g)、瑟伯氏棉D1(h)体细胞中期染色体进行FISH的杂交图片，染色体为蓝色，BAC克隆57I23为红色信号，Bar＝5μm。具体实施方式实施例1以BAC克隆57I23为探针，分别与棉属两个二倍体、5个四倍体、一个六倍体杂交种体细胞中期染色体进行杂交。1材料和方法1.1实验材料实验材料草棉、雷蒙德氏棉、陆地棉中棉所-12、海岛棉海-7124、毛棉、黄褐棉、达尔文氏棉、六倍体杂种(AADDEE)均来自于中国农业科学院棉花研究所；所筛选的BAC文库为阿非利加棉BAC文库。实验试剂纤维素酶OnazukaR-10和果胶酶Pectolyase购自Solarbio公司，生物素探针标记试剂盒购自Roche公司，其他均为国产分析纯试剂。1.2实验方法1)BAC文库的筛选：对BAC文库进行一级混合池(板池)构建，以SSR引物对所有混合池进行菌液PCR，经8％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，所得阳性混合池进行行池构建，同样进行菌液PCR、电泳检测，得到阳性行池，接下来对阳性行池进行单孔菌液PCR、电泳检测，选择含有目的片段(SSR引物Gh216的PCR产物-90bp片段)的克隆，从而获得BAC克隆57I23。2)取材及预处理：取种子在温水中浸泡过夜，种植于灭菌潮湿的本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC‑FISH方法，其特征在于，所述方法包括使用来自二倍体阿非利加棉BAC文库的BAC克隆57I23，进行原位杂交的步骤。

【技术特征摘要】
1.棉属AD或ADE背景下同时鉴别各亚组全套染色体的BAC-FISH方法，其特征在于，所述方法包括使用来自二倍体阿非利加棉BAC文库的BAC克隆57I23，进行原位杂交的步骤，所述BAC克隆57I23为SSR引物Gh216PCR扩增的序列如SE...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘玉玲，赵艳艳，刘方，周忠丽，蔡小彦，王星星，王春英，王玉红，彭仁海，王坤波，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：河南;41