昆虫几丁质去乙酰基酶基因1及其在害虫防治中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种昆虫几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)全长序列及其在农业害虫防治中的应用。具体为通过生物信息学方法，从飞蝗转录组中获取几丁质去乙酰基酶基因1片段，进一步调取获得序列为SEQ ID NO：1基因全长。依据SEQ ID NO：1，设计并合成该基因的dsRNA，将其注射进入飞蝗体腔后可以特异性沉默靶标基因，从而使飞蝗难以脱去旧表皮导致死亡。多次实验表明其致死率达到94.7％以上。由于本发明专利技术的特异性及高效的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。

【技术实现步骤摘要】
昆虫几丁质去乙酰基酶基因1及其在害虫防治中的应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)及在害虫防治中的应用。
技术介绍
飞蝗是我国重要农业害虫，其大规模迁飞对农业生产造成严重危害。目前对其防治主要依靠化学防治。长期施用化学杀虫剂导致一系列问题，如环境污染，抗药性产生和对非靶标生物的危害。因此开发新型、可替代化学防治的方法变得尤为紧迫。RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA分子引起的特异性转录后基因沉默的现象，自2006年获得诺贝尔奖以来，RNAi技术一直是生命科学的研究热点。RNAi不仅是研究基因功能的有力工具，同时在害虫防治方面也具有极大潜力。通过RNA干扰进行害虫防治具有如下优点：1)杀虫专一性，对非靶标生物无杀伤作用；2)RNA在自然界极易降解，无残留；3)对环境无毒无害，相对安全。因此学者将其称为第四代杀虫剂。基于RNA干扰进行害虫防治的前提是筛选靶标序列获得对昆虫具有高致死作用的dsRNA。昆虫表皮可以防止其体内水分散失和免受病原体侵染，几丁质是昆虫表皮的重要组成成分，几丁质致密排列对于昆虫生长发育必不可少。几丁质去乙酰基酶基因1(CDA1)负责将几丁质N-乙酰基葡糖胺的乙酰胺基水解，形成脱乙酰几丁质(或称聚葡萄糖胺，壳聚糖)，从而改变其物理性质，使表皮蛋白等其它组分更容易与几丁质结合，从而形成致密的表皮结构。沉默该靶标基因后昆虫出现蜕皮受阻而致死的现象。由于人和其他高等动物并没有几丁质，因此，本专利技术采用RNA干扰技术，针对几丁质代谢系统筛选几丁质去乙酰基酶基因1的dsRNA分子靶标相对安全，在飞蝗防治中具有重要作用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种昆虫几丁质去乙酰基酶基因1全长序列及其dsRNA，以及它们的合成方法和在害虫防治中的应用。本专利技术提供一种飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1全长序列，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。该基因全长序列是基于飞蝗转录组数据库，搜索获得的片段通过GeneDoc软件对其进行拼接，设计上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC(SEQIDNO：3)和下游引物GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQIDNO：4)，通过PCR扩增获得。该核苷酸长度为1753bp，其核苷酸序列为SEQIDNO：1。本专利技术提供一种飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1编码的氨基酸序列，其特征是核苷酸序列为SEQIDNO：2的序列。该氨基酸序列是对SEQIDNO：1进行生物信息学分析后预测得到。生物信息学分析表明CDA1基因的编码535个氨基酸，分子量为61KD，理论等电点为5.11。本专利技术提供飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1合成的dsRNA及其在害虫防治中的应用：基于飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1序列，通过primerpremier5.0软件设计含有T7启动子的上游引物taatacgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC(SEQIDNO：5)和下游引物taatacgactcactatagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQIDNO：6)，通过PCR扩增获得一段长度为586bp的两端均为T7启动子的DNA片段(SEQIDNO：7)。试剂盒纯化后按照T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)试剂盒说明体外转录合成的dsRNA。通过微量进样器将合成的dsRNA注射进入飞蝗体腔内。结果表明：注射dsRNA后飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1的mRNA表达显著降低，飞蝗出现蜕皮困难并导致死亡。本专利技术的有益效果：飞蝗五龄若虫注射dsRNA后，若虫在第7天出现蜕皮现象，但只有翅芽张开、背部弓起，旧表皮难以脱去直到死亡，死亡率达到94.7％以上。本专利技术飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1合成的dsRNA对飞蝗具有高的致死率，对于害虫防治具有重要的现实意义，可以为害虫防治提供新的途径。附图说明图1：琼脂糖凝胶检测几丁质去乙酰基基因1全长cDNA序列长度(M为DL5000DNAMarker，条带从小到大依次为100、250、500、750、1000、1500，2000、3000、5000bp，1为几丁质去乙酰基基因1条带大小)图2：dsRNA注射24h后对几丁质去乙酰基酶基因1的转录影响(1为注射dsGFP的对照组，2为注射dsRNA的实验组)。β-actin为内参基因。其中*P<0.05，**P<0.01。图3：dsRNA对5龄飞蝗若虫生长发育的影响(1为注射dsGFP的对照组，2和3均为注射dsRNA的实验组)。实验组飞蝗出现蜕皮困难死亡的表型。具体实施方式实施例1：飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1cDNA全长序列获得及氨基酸序列分析1.飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1cDNA片段获得基于飞蝗的转录组数据库，对其Unigene进行搜索，经NCBIBlastx分析后，确定获得1个飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1的片段。2.飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1cDNA全长序列获得将上述基因片段通过GeneDoc软件进行拼接，并采用primerpremier5.0软件设计上游引物CAACGTCACAACCAGTGAGTGTC(SEQIDNO：3)和下游引物GCGGTACACGATGAAAGATGG(SEQIDNO：4)，由上海英潍捷基生物有限公司合成。选取生长健康、大小一致、雌雄各半的5龄飞蝗若虫，在体式显微镜下将其表皮快速解剖下来，并冷冻于液氮中。4头一个生物学重复，依照TaKaRaTrizol试剂盒提取RNA。采用M-MLV反转录酶将所提RNA反转录成第一链cDNA。以此做为模板，结合设计上下游引物，通过PCR扩增获得几丁质去乙酰基酶基因全长片段(图1)，通过GelExtroactionKit(Omega)将PCR产物进行纯化，将纯化后的产物克隆到pEASY-T3Cloningvector(全式金公司)中，转入感受态细胞，扩大菌液培养，采用PlasmidMiniKit1(Omega)提取质粒检测后将菌液送往invitrogen公司测序公司进行测序。测序得到核苷酸序列为SEQIDNO：1的序列。3.飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1氨基酸序列分析通过ExPaSy在线软件对已获几丁质去乙酰基酶基因1进行翻译，预测几丁质去乙酰基酶基因1的开放阅读框编码535个氨基酸，分子量为61KD，等电点为5.11。功能域预测发现几丁质去乙酰基酶基因1具有信号肽，几丁质结合域(CBD)，低密度脂蛋白受体域(LDLa)和催化活性域(CDA)。飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1氨基酸与赤拟谷盗CDA1氨基酸序列的同源度达到90％。实施例2：飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1的dsRNA合成1.飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1dsRNA引物的设计基于飞蝗几丁质去乙酰基酶基因序列，采用primerpremier5.0软件设计。设计dsRNA引物，其序列分别为taatacgactcactatagggTCTGTAACGGCGAGAAGGAC(SEQIDNO：5)和taatacgactcactatagggCCATCATGGTGAACTGGTTG(SEQIDNO：6)(斜体部分为T7启动子)。所有引物均由上海英潍捷基生物有限公司合成。2、飞蝗几丁质去乙酰基酶基因本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO：1。

【技术特征摘要】
1.一种飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1，其特征在于核苷酸序列为SEQIDNO：1。2.如权利要求1所述的飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1编码的氨基酸序列，其特征在于氨基酸序列为SEQIDNO：2。3.如权利要求1所述飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1合成的dsRNA。4.如权利要求3所述dsRNA的合成方法，其特征在于包括如下步骤：按照飞蝗几丁质去乙酰基酶基因1的核苷酸序列，设计含有T7启动子的上游引物ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：张建珍，于荣荣，张敏，李大琪，马恩波，
申请(专利权)人：山西大学，
类型：发明
国别省市：山西;14