基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法，解决现有技术中基于核酸适配体的蛋白质检测的方法存在着灵敏度低，稳定性差，步骤繁琐，成本高等缺点的技术问题。方法，包括以下步骤：(1)制备锰卟啉探针；(2)蛋白质检测向化学反应器中加入20mM Tris-HCl，25μM鲁米诺和0.05％Triton X-100，再加入锰卟啉探针，最后加入包含核酸适配体和待测蛋白质的溶液；将所述化学反应器放入化学发光检测器中，最后用微量进样器加入浓度为100mM的H2O2，记录化学发光随时间的变化。该方法是基于核酸适配体诱导的锰卟啉集聚建立的快速、灵敏、特异、简便的蛋白质的检测方法。

【技术实现步骤摘要】
基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法
本专利技术涉及一种检测方法，具体涉及一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法。
技术介绍
蛋白质(protein)是生命的物质基础，没有蛋白质就没有生命，它与各种形式的生命活动紧密联系。蛋白质的定量及分析检测对基础研究及临床应用起着非常重要的作用。现阶段，在医学诊断以及分析化学等领域，检测蛋白质的最普遍的方法还是基于抗原–抗体的特异性作用。由于抗原与抗体间的亲和作用较强，检测方法具有很高的灵敏度和较好的特异性。而基于免疫的检测方法也有它的缺点：抗体的筛选、鉴定、及分离过程依赖于动物和细胞培养，而且检测过程需要进行抗体的固定、信号输出基团的修饰，这无疑增加了研究工作的难度和要求。核酸适配体是通过指数腹肌的配体系统进化技术(SELEX)筛选而获得的具有特异性序列的寡聚核苷酸片段，它对其靶分子具有高度的亲和力，并且可以通过化学生产获得，被誉为“化学抗体”。近些年，许多研究者利用核酸适配体来替代抗体进行蛋白质检测。但目前已见报道的基于核酸适配体的蛋白质检测的方法，主要存在着灵敏度低，稳定性差，步骤繁琐，成本高等缺点。
技术实现思路
本专利技术要解决现有技术中基于核酸适配体的蛋白质检测的方法存在着灵敏度低、稳定性差、步骤繁琐、成本高等缺点的技术问题，提供一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法，该方法是基于核酸适配体诱导的锰卟啉集聚建立的快速、灵敏、特异、简便的蛋白质的检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案具体如下：一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法，包括以下步骤：(1)制备锰卟啉探针；(2)蛋白质检测向化学反应器中加入20mMTris-HCl，25μM鲁米诺和0.05％TritonX-100，再加入锰卟啉探针，最后加入包含核酸适配体和待测蛋白质的溶液；将所述化学反应器放入化学发光检测器中，最后用微量进样器加入浓度为100mM的H2O2，记录化学发光随时间的变化。在上述技术方案中，制备锰卟啉探针的具体步骤如下：在50mL的容量瓶中加入5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉101mg，MnCl2·4H2O16mg，将其溶解于10mL甲醇中，在氮气保护下加热回流进行配位反应，配位反应完成后用氯离子交换树脂交换24小时，然后用乙酸乙酯沉淀，过滤，得到的紫黑色固体在真空烘箱中烘干，制备得到锰卟啉探针；合成路线如下：在上述技术方案中，所述核酸适配体的碱基浓度为12.5μM。在上述技术方案中，所述锰卟啉探针的浓度为5μM。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供的一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法是通过核酸适配体诱导的锰卟啉集聚，进而导致其催化化学发光能力的减弱。利用核酸适配体控制的卟啉催化能力的变化，开发了灵敏检测蛋白质的方法。该方法与现有方法相比：(1)锰卟啉合成容易，测试成本低；(2)鲁米诺和过氧化氢是常见的化学发光体系，操作简单；(3)测试可直接在小烧杯的大体系中实时检测，且即混即测，简便快速；(4)测试给出的是积分化学发光增强的信号，比起减弱的信号，灵敏度更高。附图说明下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。图1为核酸适配体浓度对锰卟啉催化的的化学发光的影响图；其中(a)为存在不同碱基浓度的核酸适配体下的积分化学发光曲线随时间的变化图；(b)为反应时间为1min时积分化学发光与核酸适配体碱基浓度的关系图。图2为不同浓度的VEGF165的检测图；其中(a)为积分化学发光曲线随时间的变化图；(b)反应时间为1min时积分化学发光与VEGF165浓度的关系图。图3为本专利技术提供的检测方法的选择性考察图。图4为利用核酸适配体诱导的锰卟啉集聚检测蛋白质原理图。具体实施方式本专利技术提供的检测方法的专利技术原理为：参见图4所示：(1)锰卟啉探针(MnTMPyP)在水溶液中以自由单体形式存在，能够很好的催化鲁米诺和过氧化氢的化学发光。(2)核酸适配体带有很多个负电荷，可以作为聚阴离子，当溶液中加入核酸适配体后，由于锰卟啉分子带有四个正电荷而核酸适配体带有负电荷，两者之间因强烈的静电作用导致锰卟啉分子的集聚，从而使锰卟啉催化的化学发光淬灭。淬灭程度随着核酸适配体量的增加而增大。(3)在体系中加入能够与核酸适配体特异性结合的蛋白质后，核酸适配体与蛋白质结合，锰卟啉分子被释放出来，锰卟啉分子由集聚态变回自由的单体，从而其催化能力恢复，化学发光恢复。化学发光恢复的程度与加入的蛋白质的量存在线性关系，据此可以实现对蛋白质的定量检测。下面结合附图对本专利技术做以详细说明。本专利技术的检测方法所使用的核酸适配体浓度的选择：向玻璃小烧杯加入970μL的缓冲溶液(该缓冲溶液包含20mMTris-HCl，25μM鲁米诺，0.05％TritonX-100)，再加入2μL5μMMnTMPyP，最后加入4μL不同浓度的适配体(对应的适配体的碱基浓度分别为0μM，2.5μM，5μM，7.5μM，10μM，12.5μM，15μM，17.5μM)和4μL水，这时小烧杯中总体系为980μL，将小烧杯放入化学发光检测器中，最后用微量进样器加入浓度为100mM的H2O220μL，记录化学发光随时间的变化。如图1所示，积分化学发光强度最低时的核酸适配体的在终体系中的碱基浓度为50nM。也就是说在980μL体系中需要加入4μL碱基浓度为12.5μM的核酸适配体。图1(a)具体说明了核酸适配体能够诱导锰卟啉探针的集聚并导致其催化能力的降低，取图1(a)中反应时间为1min钟时的积分化学发光强度为纵坐标，核酸适配体的碱基浓度为横坐标我们可以得到图1(b),进而由图1(b)确定VEGF检测时所加的核酸适配体的量。本专利技术的检测方法的选择性考察：向玻璃小烧杯加入970μL的缓冲溶液(该缓冲溶液包含20mMTris-HCl，25μM鲁米诺，0.05％TritonX-100)，再加入2μL5μMMnTMPyP，最后加入4μL碱基浓度为12.5μM的核酸适配体，4μL浓度为3.75μMVEGF及干扰蛋白(PDGF,Thrombin,胰蛋白酶，牛血清蛋白，胶原蛋白酶)，这时小烧杯中总体系为980μL，将小烧杯放入化学发光检测器中，最后用微量进样器加入浓度为100mM的H2O220μL，记录化学发光随时间的变化。如图3所示，A、B、C、D、E分别代表PDGF、Thrombin、胰蛋白酶、牛血清蛋白、胶原蛋白酶。由图可以看出其它的蛋白均没有明显的干扰，证明我们的方法具有很好的选择性。实施例1(1)制备锰卟啉探针在50mL的容量瓶中加入5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉(TMPyP)101mg，MnCl2·4H2O16mg，将其溶解于10mL甲醇中，在氮气保护下加热回流，监测反应溶液的紫外可见光谱。卟啉的Soret吸收带最大吸收峰值由422nm处移动到463nm处，表示卟啉与锰已经配位。配位反应完成后利用氯离子交换树脂交换24小时，然后用乙酸乙酯沉淀，过滤，得到的紫黑色固体在真空烘箱中烘干，制备得到锰卟啉探针(MnTMPyP)。合成路线如下：(2)VEGF165的检测向玻璃小烧杯加入970μL的缓冲溶液(该缓冲溶液包含20mMTris-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备锰卟啉探针；(2)蛋白质检测向化学反应器中加入20mM Tris‑HCl，25μM鲁米诺和0.05％Triton X‑100，再加入锰卟啉探针，最后加入包含核酸适配体和待测蛋白质的溶液；将所述化学反应器放入化学发光检测器中，最后用微量进样器加入浓度为100mM的H2O2，记录化学发光随时间的变化。

【技术特征摘要】
1.一种基于核酸适配体和锰卟啉催化的化学发光检测蛋白质的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备锰卟啉探针在50mL的容量瓶中加入5,10,15,20-四(1-甲基-4-吡啶基)卟啉101mg，MnCl2·4H2O16mg，将其溶解于10mL甲醇中，在氮气保护下加热回流进行配位反应，配位反应完成后用氯离子交换树脂交换24小时，然后用乙酸乙酯沉淀，过滤，得到的紫黑色固体在真空烘箱中烘干，制备得到锰卟啉探针；合成路线如下：(2)...

【专利技术属性】
技术研发人员：于聪，李文英，张青峰，陈健，周会鹏，李永新，
申请(专利权)人：中国科学院长春应用化学研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22