一种功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法技术

本发明专利技术公开了功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法，其特征在于：采用核酸适配体‑磁纳米粒子复合物探针，通过HRP‑OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。与传统的ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，本发明专利技术充分结合了磁性纳米材料快速分离及富集效应、核酸适配体的高特异性和酶标板的高通量筛选特性，可大大缩短检测时间，提高检测灵敏度和特异性，降低检测成本。

【技术实现步骤摘要】
一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法
本专利技术涉及食品中土霉素的检测方法，属于食品安全分析

技术介绍
土霉素(Oxytetracycline，OTC)，别名5-羟基四环素，地霉素，地灵霉素，氧四环素等，是一种广谱抗菌药物，常作为牛、猪、家禽、鱼等动物疾病的预防和感染的治疗用药。然而由于滥用及不遵守休药期规定等原因，造成其在畜产品中的残留，不仅给人类健康带来严重危害，也给环境造成了严重威胁。世界粮农组织、世界卫生组织、欧盟及我国政府对食品中土霉素的残留限量作了规定。目前，土霉素检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳法(CE)、液相色谱-质谱法(HPLC-MS)、酶联免疫吸附法(ELISA)等。但仪器分析方法设备昂贵，前处理繁琐。快速检测方法通常采用抗原抗体特异相互作用识别模式，但由于受到抗体易失活、制备依赖免疫动物和细胞、繁琐费时、一些小分子物质难以产生特异性抗体等因素的影响，在一定程度上限制了抗体在快速检测技术中的应用。核酸适配体（Aptamer）技术的出现弥补了抗体在相关检测领域中应用的不足。目前已有利用核酸适配子为识别分子应用于食品中土霉素检测的报道。如刘宾（暨南大学硕士论文）建立了基于配适体的生物素-亲和素酶联检测土霉素的分析方法，但检测限（1.5g/L）不能满足土霉素检测的需要（限量值：100mg/kg）。Kimetal.（Anal.Chim.Acta,2009,634:250-254）建立了适配体电化学传感器检测土霉素的分析方法，但适配体固定步骤相对耗时，且样品基质对电化学信号易造成干扰。2010年他又利用纳米金修饰的适配体为探针比色检测土霉素（Biosens.Bioelectron26:1644-1649），但无法精确定量。2014年Kimetal.（Biosens.Bioelectron51:426–430）基于ELISA原理，建立了牛奶中土霉素的间接酶联适配体分析（ic-ELAA）方法，检测限为12.3ng/mL，但方法需要将OTC–BSA包被于酶标板，造成检测时间较长（>10h）。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简单、检测快速、灵敏度高、成本低的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法。本专利技术的目的通过以下技术方案来具体实现：一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，采用核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。其原理是将适配体通过生物素-亲和素系统固定于纳米磁珠表面，辣根过氧化酶酶标记OTC（HRP-OTC）与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC适配体，通过底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。检测原理如图1所示。核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针的制备，采用文献（WuSJ,DuanN,WangZP,etal.Analyst,2011,136,2306-2314）报道的方法进行制备。进一步的，所述的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联。进一步优选，所述OTC核酸适配体的5’端修饰了生物素，通过生物素-亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面。作为优选方案，上述的功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，包括如下步骤：1）HRP-OTC与OTC直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC适配体：a.将步骤1）中制得的纳米磁珠分散于PBS中，取100μL添加到酶标板孔中，磁分离，去上清；b.每孔中加入200µL封闭液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的封闭液；c.然后于每孔中依次加入50μLHRP-OTC和50μLOTC标准品溶液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤液洗涤；d.每孔中加入100μLTMB底物显色液，37℃避光反应20min；e.最后每孔中加入100μL终止液终止反应，酶标仪450nm测吸光值；2）标准曲线的绘制按步骤1）的操作步骤对土霉素标准品进行检测，建立标准曲线，OTC标准品浓度依次为0.5、1、2、5、10、25、50、100ng/mL，以不同土霉素浓度的对数为横坐标，以抑制率B/B0为纵坐标作图，绘制标准曲线，建立回归方程，B0：OTC标准品浓度为0ng/mL所对应的吸光度；B：OTC标准品不同浓度所对应的吸光度；3）将食品样品提取液代替标准品溶液，按照步骤1）所述步骤进行检测，根据步骤2）的标准曲线计算食品样品中OTC的含量。进一步优选的，所述步骤1）的步骤a中，核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针分散后的浓度为1.0mg/mL。进一步优选的，所述封闭液为0.1%BSA。进一步优选的，所述终止液为2.0mol/L的H2SO4溶液。根据标准曲线计算计算IC50值为14.47ng/mL（IC50值：抑制率为50%所对应的药物浓度）和检测限LOD为0.88ng/mL（LOD：吸收值为B0-空白对照3倍标准偏差所对应的标品浓度）本专利技术针对传统大型仪器不能实现现场快速检测、前处理繁琐、以及免疫分析方法需要制备抗体的缺点，利用纳米磁珠快速分离及有效富集靶物质的优点，适配体的高特异性和选择性特点，及酶标板的高通量筛选特性，建立了磁珠分离-酶联适配体检测方法，可用于食品中土霉素残留的快速（检测时间：100min）、高灵敏（LOD：0.88ng/mL）检测。与传统的ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，本专利技术提高了检测速度、灵敏度和特异性，降低了检测成本。与传统ELISA和酶联适配体（ELAA）相比，优点如下：（1）此方法不需要制备抗体，适配体可体外人工合成，制备简单，节约劳动力；（2）检测成本低于传统的免疫分析方法；（3）相对于微孔板，磁纳米颗粒可充分发挥比表面积及小尺寸效应，提供更多的结合位点，提高检测的特异性；（4）相对于以微孔板为载体的ELAA分析方法，适配体不需要包被在酶标板上，缩短了分析时间（本专利技术检测时间为100min，以微孔板为载体的ELAA分析方法则需要10h以上），同时适配体修饰磁珠均匀分散于溶液中，加快了识别分子与靶物质的结合速率，使检测速度大大提高；（5）在外加磁场的作用下通过磁分离可实现样品一步分离和靶物质有效富集，使洗涤更彻底，降低基质干扰，提高了分析方法的信噪比与灵敏度。附图说明图1是功能化纳米磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的原理图；图2是氨基化纳米磁珠扫描电镜图；图3是氨基化纳米磁珠红外表征图；580cm-1为Fe–O的伸缩振动，2854、2920和3433cm-1为C–H和N–H的伸缩振动，1633cm-1为氨基化纳米材料上的N–H的变形振动。图4是亲和素结合纳米磁珠的紫外扫描图，a.亲和素原液吸光值；b.亲和素结合纳米磁珠后的上清液吸光值；图5是磁珠分离-酶联适配体检测土霉素的标准曲线图；图6是本专利技术与国标方法检测同一样品中土霉素的相关性曲线。具体实施方式以下对本专利技术的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种功能化磁珠分离‑酶联适配体检测食品中土霉素的方法，其特征在于：采用核酸适配体‑磁纳米粒子复合物探针，通过HRP‑OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC核酸适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量。

【技术特征摘要】
1.一种功能化磁珠分离-酶联适配体检测食品中土霉素的方法，其特征在于：采用核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针，通过HRP-OTC与样品中的OTC直接竞争结合磁珠表面的OTC核酸适配体，底物显色检测吸光值变化来定量分析样品中土霉素含量；所述的核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针为生物素修饰的适配体连接亲和素修饰的纳米磁珠，即采用化学共沉淀法制备Fe3O4纳米颗粒，然后利用戊二醛法将氨基化的纳米磁珠与亲和素偶联；所述OTC核酸适配体的5’端修饰了生物素，通过生物素-亲和素系统，同时固定于亲和素修饰的纳米磁珠表面；所述方法包括如下步骤：1）HRP-OTC与OTC直接竞争结合固定于纳米磁珠表面的OTC适配体：a.将核酸适配体-磁纳米粒子复合物探针分散于PBS中，取100μL添加到酶标板孔中，磁分离，去上清；b.每孔中加入200μL封闭液，37℃孵育40min，磁分离，PBST洗涤多余的封闭液；c.然后于每孔中依次加入50μLHRP-O...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢春霞，唐宗贵，刘长彬，孙凤霞，康立超，陈霞，王国红，
申请(专利权)人：新疆农垦科学院，
类型：发明
国别省市：新疆;65