一种木本植物的活体表达方法技术

本发明专利技术公开了一种木本植物的活体表达方法，该方法包括：植物样品的制备，超表达载体的构建，农杆菌的侵染转化以及植物超表达载体的遗传转化等步骤。通过构建超表达载体pCAMBIA1304-CmKAO和干扰载体CmKAO-RNAi，在野生和芽变短雄花序的雄花序原基形成期，以农杆菌介导携带有KAO基因载体菌液，分别在雄花序上进行注射和涂抹，建立了板栗花序的瞬时超表达和干扰体系。板栗雄花序活体-瞬时转化系统的建立对于童期长、再生体系不完善的植物来讲，使得在其亲本上验证基因功能得以实现，且大大缩短了转化周期，对于其它植物尤其是木本植物活体-瞬时系统的转化提供了有价值的参考。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种木本植物的活体表达方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：（1）植物样本的制备提供植物的RNA样本，加入无RNA活性的DNA酶，消化总RNA中的DNA，测定RNA的完整性和浓度，检测特征吸光度的比值达到要求，得到总RNA样品；使用反转录酶对所述总RNA样品进行反转录得到cDNA，冷冻保存；（2）超表达载体的构建以步骤（1）所述的cDNA为模板进行PCR扩增，对CmKAO基因进行克隆；回收目的DNA片段后，连接T载体；通过蓝白斑（α‑互补）筛选和菌液PCR鉴定，获得阳性克隆产物；通过序列分析提取含有T载体的CmKAO 重组质粒DNA；选取pCAMBIA1304载体上多克隆位点的酶切位点，对含有T载体的CmKAO重组质粒DNA及载体质粒DNA进行酶切和连接，培养筛选重组子pCAMBIA1304‑CmKAO，通过相同的双切酶检测获得pCAMBIA 1304‑CmKAO超表达载体；（3）农杆菌的侵染转化选取一定量的LGV3101农杆菌感受态细胞，加入步骤（2）所述的pCAMBIA 1304‑CmKAO超表达载体，进行细胞培养，挑取菌落，PCR检测后保存菌种；将菌种在培养基上划线培养，检测OD，用侵染液调节OD值，活化后，对活体植物组织进行侵染；（4）植物超表达载体的遗传转化将含有步骤（3）所述的CmKAO超表达载体的农杆菌分别侵染突变体组织和野生型组织，侵染后采样提取DNA，以1304J为引物进行鉴定，实时荧光定量和半定量PCR检测，完成植物的活体表达。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦岭，曹庆芹，邢宇，张卿，杨柳，房克凤，
申请(专利权)人：北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京;11