本发明专利技术属于微生物技术领域，具体涉及一株从发酵豆制品中筛选出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。本发明专利技术的戊糖片球菌F28-8（Pediococcus pentosaceus），于2014年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9956。本发明专利技术的戊糖片球菌具有高凝聚活性，可用于水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理，而避免使用化学抑菌剂和抗生素来进行水体减菌和净化处理，为养殖和暂养水体中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同时有利于预防副溶血性弧菌引起的水生动物疾病和食源性疾病的传播。
【技术实现步骤摘要】
一株高凝聚性戊糖片球菌及其在净化水体中副溶血性弧菌中的应用
本专利技术属于微生物
，具体涉及一株从发酵豆制品中筛选出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。
技术介绍
副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus），广泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海产品引发食物中毒的重要病原菌，也是水产动物细菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生动物弧菌病、降低水体中副溶血性弧菌载量的重要手段是使用抗生素及化学制剂，但随之导致耐药性细菌产生及抗生素残留等问题，对食品安全造成重大影响，因此亟需开发新的手段来进行水体减菌和净化处理。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理，而避免使用化学抑菌剂和抗生素来进行水体减菌和净化处理，为养殖和暂养水体中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同时有利于预防副溶血性弧菌引起的水生动物疾病和食源性疾病的传播。本专利技术从发酵豆制品卤水中分离出一株戊糖片球菌F28-8（Pediococcuspentosaceus），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNo.9956，保藏日期为2014年11月13日，菌种的分类命名为戊糖片球菌，Pediococcuspentosaceus。本专利技术中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物学特性：（1）形态特征：戊糖片球菌F28-8革兰氏染色结果为阳性，细胞呈圆球形，成对或四联排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。（2）菌落特征：戊糖片球菌F28-8在MRS固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。（3）生理生化特征：过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，不发酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可从纤维二糖、七叶苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。（4）对副溶血性弧菌具有强烈的凝聚性和抑菌性。本专利技术从发酵豆制品中的戊糖片球菌中分离出戊糖片球菌分离株，通过测定其对副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，筛选出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通过电镜来观察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微观结构，测定其对水体中致病性副溶血性弧菌存活率的影响来考察其对水体中副溶血性弧菌净化效应，具体包括以下步骤：（1）菌株复苏培养戊糖片球菌F28-8接种5mLMRS液体培养基，tdh基因阳性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接种LBS液体培养基，备用。（2）抑菌能力测定用琼脂孔扩散法，通过测定戊糖片球菌菌株无细胞提取液对副溶血性弧菌在LBS固体平板上的抑菌圈的大小来检测其抑菌能力。（3）共凝聚能力测定调节戊糖片球菌的菌悬液的浓度，将调好浓度的戊糖片球菌悬液与相应的副溶血性弧菌菌悬液各取混合，测定吸光值，记作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液作为对照，按照以下公式：{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100来计算细菌共凝聚率，其中Ap和Av分别为戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌悬液在600nm处测所测的A值。（4）凝聚细胞的电镜观察吸取自凝聚2h的未混合戊糖片球菌的菌悬液样品进行扫描电镜，吸取共凝聚2h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌悬液样品进行扫描电镜，分别观察细胞的结构和凝聚特征。（5）凝聚过程中副溶血性弧菌存活细胞测定将戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌悬液在37℃混合静置培养2h、12h、24h、60h、96h后，分别吸取样品中上层和下层溶液通过选择性TCBS琼脂平板测定体系中的细菌浓度。本专利技术的有益效果是：戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus），是乳酸菌中的一个种，广泛分布于蔬菜、干酪、香肠等传统发酵食品中，是公认的具有安全性的微生物。该菌代谢糖类产生乳酸，并产生IIa类片球菌素，对病原菌及腐败微生物产生强烈的抑制效应，其中一些菌株具有提高动物天然免疫能力、促进健康以及抵抗病原菌的侵袭等益生特性，以戊糖片球菌及其代谢产物研发新型抑菌剂和微生态制剂对食品和环境中弧菌净化控制以及弧菌病的生物防治具有潜在价值和广阔前景。本专利技术的戊糖片球菌F28-8对致病性副溶血性弧菌具有较强的抑菌性能、共凝聚能力，其抑菌活性对氧化氢酶、蛋白酶以及高温条件均不敏感，因此可应用范围广。电镜显示该菌具有独特的细胞表面结构和细胞粘聚方式，易于自凝聚形成大的团簇，并与副溶血性弧菌形成紧密的共凝聚物，从而对水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理。水体中的副溶血性弧菌经戊糖片球菌F28-8的共凝聚作用后，上层悬液和凝聚物中的可培养细胞均显著减少。附图说明图1：不同凝聚性的戊糖片球菌细胞的扫描电镜结果。图2：戊糖片球菌共凝聚对水体中副溶血性弧菌可培养细胞数的影响。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本专利技术实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本专利技术实施例所用试剂均为市购。实施例1菌株复苏培养将戊糖片球菌保种液于0℃解冻，无菌吸取200μL保种液接种于10mL的MRS液体培养基中，在37℃厌氧条件下培养24h，取培养物划线接种于MRS固体平板上，在37℃厌氧培养24h，然后挑取单菌落接种于5mL的MRS液体培养基，在37℃厌氧条件下培养24h，备用。将tdh基因阳性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接种于LBS液体培养基，在37℃振荡培养16h；取培养物划线于TCBS平板，在37℃培养20h，挑取单菌落接种5mLLBS液体培养基，在37℃恒温振荡条件下培养12h，备用。实施例2抑菌能力测定戊糖片球菌F28-8、Y27-4、Y45-30、H13,、H6、H10和F3的抑菌能力对比测定：在70℃、100℃、121℃不同温度下分别将戊糖片球菌培养物12000g离心15min，取上清液，通过0.22µm的微孔滤膜除菌，获得戊糖片球菌培养物无细胞提取液。使用琼脂孔扩散法对菌株无细胞提取液的抑菌能力进行测定：用无菌生理盐水将副溶血性弧菌的菌悬液稀释到108CFU/mL，移取1mL菌悬液于LBS固体平板中，涂布均匀，于超净工作台中晾干15min，用打孔器在平板中均匀打直径为10mm的小孔，每孔加入200µL戊糖片球菌培养物无细胞提取液和用9mg/mL过氧化氢酶、1mg/mL蛋白酶K和1mg/mL胰蛋白酶处理。将三个不同条件70℃、100℃、121℃下处理的菌株分别各做3孔平行，室温扩散5h，然后放置于37℃下培养过夜，用游标卡尺进行测量并记录抑菌圈直径。将MRS液体培养基用乳酸调节pH到与作为对照的受试菌株无细胞提取液的pH相同，并比较不同处理组的抑菌效果。本研究试验中的7株戊糖片球菌的代谢产物对致病性副溶血性弧菌ATCC33847都显示了强烈的抑制效应，抑菌圈直径在21.0mm至25.5mm之间，是同pH乳酸对照的1.1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株戊糖片球菌F28‑8（Pediococcus pentosaceus），于2014年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9956。
【技术特征摘要】
1.一株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)F28-8，于2014年11月13日保藏在中国微生物菌种...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨振泉，高璐，饶胜其，靳彩娟，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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