鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针技术

本发明专利技术公开了一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针，根据禽痘病毒基因组DNA中P4b基因序列设计特异性引物对和探针，建立了鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，本方法具有靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低，灵敏度高，可对产物进行定量，操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步实现对鸭痘病毒快速准确检测并鉴定。

【技术实现步骤摘要】
鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法及检测用引物和探针
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种鸭痘病毒检测方法，尤其涉及一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法；此外，本专利技术还涉及检测鸭痘病毒的引物和探针。
技术介绍
鸭痘病毒（duckpoxvirus）为痘病毒科（Poxviridae），脊椎动物痘病毒亚科（Chordopoxvirinae），禽痘病毒属（Avipoxvirus）的成员。鸭痘是由鸭痘病毒引起家鸭或野生水禽的一种病毒性传染病，临床表现为体表无羽毛部位出现散在的、结节状的增生性皮肤病灶（皮肤型），或上呼吸道、口腔和食管黏膜出现纤维素性坏死和增生性病灶（白喉型），也可能同时发生全身性感染。禽群发生温和性皮肤型鸭痘时，死亡率较低，但影响动物采食和生长；而发生全身性感染，特别是白喉型鸭痘，或者有并发感染或饲养管理差时，死亡率较高，可给养鸭业造成较严重的经济损失。过去，鸭痘主要在北美地区的麻鸭（mallardduck）、黑嘴天鹅（trumpeterswan）、北美斑鸭（mottledduck）、赤头鸭（redheadduck）和蓝翅鸭（blue-wingedteal）等野生水禽中被发现。近年来，我国部分地区的麻鸭饲养场也相续暴发鸭痘疫情，并造成较为严重的经济损失。据文献报道，鸭痘是由痘病毒引起的一种急性传染病。其临诊特征是在皮肤、口腔或眼睛上出现痘斑症状和病变：病初体温稍高，迟钝，食欲下降，产蛋下降或完全停止。鸭痘的病症有以下几种形式：1、皮肤型：在鸭的嘴角和与鸭喙连接的皮肤上、眼睑处皮肤上出现大小不等的结节状痘样疹，并经常汇集成较大的疣状结节：其他如跗跖关节以下的足部趾或蹼上，也会出现结节状痘样疹，此病例约占3％。2、口腔型：最初在口腔黏膜上现灰白色痘疹，在口角处有结节样疹痘疹逐渐变黄，后期形成溃疡，经10～15d愈合，不形成伪膜。3、眼型：病初有水样分泌物，后来逐渐成脓性结膜炎，常将上下眼睑黏、合在一起，严重时町导致一侧或两侧眼睛失明。一般鸭痘的病变除化脓外，痘样结节状病变干涸后成痂，痂脱落后留一下一暂时性的瘢痕。很多养鸭专业户没有遇见过鸭痘病毒，所以即使看见症状也无法进行判断而失去了防病治病的时机。由于鸭痘在我国是新发现的疫病，目前尚缺乏针对性的检测技术和方法，无法开展相关病原学和流行病学研究，以科学评估该病对家养麻鸭、其他品种家禽和野生禽类的危害及其程度，并制订出针对性的防控措施。因此，迫切需要发展快速、准确的鸭痘病毒检测方法。近年来，实时荧光定量PCR技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析、突变和多态性研究、病原体的定性和定量检测等方面得到广泛应用。荧光定量PCR定义：是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过cr值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。探针法实时荧光定量PCR原理：PCR扩增时在体系中含有引物的基础上再加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苦酸，两端分别标记一个报告荧光基团(R)和一个淬灭荧光基团(Q)。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5‘一3‘外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。目前仍末见探针法实时荧光定量PCR技术用于鸭痘病毒检测。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对当前鸭痘病毒特异性检测技术手段的缺乏，提供一种鸭痘病毒的实时荧光检测方法及检测用引物和探针。该检测方法的检测灵敏度可达100个拷贝的病毒分子，对于单个样本检测时间为2个小时，可同时进行大批量的样本检测，具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性，可以实现对鸭痘病毒快速准确检测并鉴定的目的。在本专利技术的一方面，提供一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征包括：（1）针对鸭痘病毒P4b基因设计能够检测鸭痘病毒的特异性引物和探针序列；（2）采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记探针序列；（3）将用于检测鸭痘病毒的引物和探针置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。在本专利技术的另一方面，提供一种用于检测鸭痘病毒的引物，其特异性引物对序列为：上游引物：5’-TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3’，下游引物：5’-TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3’。在本专利技术的另一方面，提供一种用于检测鸭痘病毒的探针，其特异性探针序列为：5’-CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3’。在本专利技术的另一方面，提供检测鸭痘病毒的实时荧光PCR检测的反应程序，上述步骤（3）中所述实时荧光PCR检测的反应程序为：预变性95℃5min;然后95℃30sec,60℃30sec循环40次。本专利技术采用实时定量荧光PCR进行鸭痘病毒的特异性检测，具有以下优点：（1）特异性好，由于TaqMan荧光探针能基于核酸杂交原理对被检分子进行甄别，具有极高的准确性，同时，靶序列由引物和荧光探针双重控制，特异性好，假阳性低；（2）灵敏度高，荧光检测技术是极灵敏的检测技术，本方法的检测灵敏度可达100个拷贝的病毒分子；（3）可对产物进行定量，由于荧光信号的强度和每次扩增产物量成意义对应的线性关系，通过荧光信号的检测可以直接对产物进行定量。（4）操作简便，自动化程度高，扩增和检测一步完成。（5）养殖户通过本专利技术的鸭痘病毒检测方法，能够尽快知道是否鸭子患有鸭痘病毒，及早采取措施，减少损失。附图说明图1为本专利技术实施例1鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验结果。曲线1~4为4份鸭痘样品的特异性扩增曲线，Ct值均小于32；曲线5~8为阴性对照（水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。图2为本专利技术实施例2鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法的特异性试验结果。曲线1为鸭痘组织样品（TD1）的特异性扩增曲线，Ct值均小于32；曲线2~11分别为H9N2亚型禽流感病毒、H5N2亚型禽流感病毒、鸭黄病毒、鸭肝炎病毒、新城疫病毒、山羊痘病毒、鸡痘病毒、鸭瘟病毒、小鹅瘟病毒和阴性对照（水）扩增结果，无Ct值并且无特异性的扩增曲线。图3为本专利技术实施例3鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法的灵敏性试验结果。曲线1~7分别为100、101、102、103、104、105和106个拷贝数阳性模板的扩增曲线。由图3表明该方法检测灵敏度可达100个拷贝。具体实施方式下面结合附图和实施例和附图对本专利技术做进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按常规条件。实施例1鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法的有效性试验1、设计引物和探针针对鸭痘病毒P4b基因设计能够检测鸭痘病毒的特异性引物和探针序列：上游引物：5’-TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3’，下游引物：5’-TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3’。荧光探针：5’-CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3’上下游引物和荧光探针均由Life公司合成，其中荧光探本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）针对鸭痘病毒P4b基因设计能够检测鸭痘病毒的特异性引物和探针序列；（2）采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX或CY5任意一种荧光素标记探针序列；（3）将用于检测鸭痘病毒的引物和探针置于同一反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应。

【技术特征摘要】
1.一种鸭痘病毒的实时荧光PCR检测用特异性引物和特异性探针，其特征在于，所述的特异性引物对序列为：上游引物：5’-TGCTAAACAACAAAGGCCTATGC-3’；下游引物：5’-TCCAGAATCTGGGACACTTTTACA-3’；所述的特异性探针序列为：5’-CTTCGCAGTAGCAAACAAAAGCCCGAT-3’；所述的探针序列采用FAM、VIC、HEX、JOE、NED、TAMRA、CY3、RO...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑敏，曹慧慧，孙文超，韦显凯，蒙振亩，郑列丰，苏娇秀，梁晟，李军，
申请(专利权)人：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：广西;45