一种盐酸万古霉素的分离纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：（1）万古霉素粗品通过离子交换层析法得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩得到浓缩液；（2）先用盐酸溶液调节浓缩液，再将调节后的浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析；（3）收集万古霉素B的层析液以得到混合层析液；（4）用盐酸调节混合层析液，然后经过纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到浓缩液；（5）进行脱水干燥步骤（4）的浓缩液，或者通过溶剂结晶或盐析法结晶以得到色谱纯度达到99%，外观纯白的盐酸万古霉素粉。本发明专利技术的方法不仅提高了产品品质，而且适合于扩大的商业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种盐酸万古霉素的分离纯化方法
本专利技术涉及一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法。该方法以色谱纯度为90%左右的万古霉素粗品为原料，首先通过以含盐-水为流动相的葡聚糖凝胶柱进行层析，收集色谱纯度大于95%的盐酸万古霉素并进行纳滤脱盐浓缩至100mg/ml-200mg/ml，然后经过反相C18硅胶色谱柱或反相聚合物色谱柱，用含铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶液作为流动相进行洗脱，收集色谱纯度大于98.5%的盐酸万古霉素，再通过纳滤脱去溶剂，然后浓缩至150mg/ml-250mg/ml进行冷冻干燥，得到色谱纯度达到99%，外观纯白的盐酸万古霉素。
技术介绍
盐酸万古霉素是放线菌属东方拟无枝酸菌在控制发酵条件下产生的一种两性糖肽类抗生素，其化学式为C66H75Cl2N9O24·HCl，分子量为1.486。已知盐酸万古霉素与黏肽的前质末端D-Ala-D-Ala结合，抑制细菌细胞壁的合成。此外，盐酸万古霉素还可以改变细胞膜的渗透性和RNA的合成。盐酸万古霉素特别用于由抗β-乳胺抗生素的葡萄球菌引起的严重或重症感染的初步治疗，也用于治疗对青霉素过敏或使用青霉素和头孢菌素没有效果的患者。早期有文献报道认为盐酸万古霉素有严重的肾、耳毒性，故在临床上未被广泛使用，但近来由于抗生素的大量使用，导致临床上耐甲氧西林金葡菌（MASA）感染病例日益增多，使得盐酸万古霉素的使用量逐年增长。因此，降低盐酸万古霉素的使用毒性，增加用药的安全性变得非常重要，而其中提高药用盐酸万古霉素的纯度是其中的一种有效的手段。近年来，随着科学技术的不断发展，技术人员不断的提高了盐酸万古霉素的纯度，过去认为盐酸万古霉素所具有的严重的肾、耳毒性在不断的减少。基于以上原因，开发一种更高纯度、简易可行、适于工业化生产的盐酸万古霉素精制工艺有着十分重要的意义。万古霉素分子由两个基本结构组成，即糖基部分α-o-vancosamine-β-o-glucosyl和肽基部分中心七肽核，其结构决定了它的不稳定性，万古霉素分子在酸碱或高温条件下会降解产生降解产物，同时结构还带有多个游离酚羟基，导致其易氧化成醌式。已有文献报道了，万古霉素在酸性条件和高温条件下会发生水解，脱去一个糖基或二个糖基生成单糖万古霉素或无糖万古霉素（desvancosaminylvancomycinandaglucovancomycin），在弱酸环境下，也可能脱去一个酰胺基降解成去氨基万古霉素，它有两个异构体。基于万古霉素化学结构的这些特点，给制造高纯度盐酸万古霉素带来了一定的困难。盐酸万古霉素产品开发已有几十年的历史，早期的制备工艺普遍采用如甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等溶剂进行结晶，也有通过加入氯化铵或氯化钠进行盐析法沉淀的方式制备成品，但由于万古霉素发酵液中存在较多的杂质，尤其是万古霉素结构类似物较多，使得纯度普遍不高，要达到色谱纯度大于93%的欧洲药典标准有一定的难度。近些年随着各种介质的色谱分离技术的发展，该技术在盐酸万古霉素分离纯化上得到了广泛的应用。CN200710187300.5采用离子交换填料葡聚糖凝胶SephadexCM-25、琼脂糖SPSepharose或琼脂糖CMSepharose进行色谱层析，流动相为4-6%的碳酸氢铵，得到色谱纯度大于95%，小于98%的盐酸万古霉素，再通过加入氯化钠溶液进行盐析沉淀，分离并用乙醇顶洗，烘干得到盐酸万古霉素成品。该工艺能得到纯度较高的盐酸万古霉素霉素，回收率不高，另外离子交换色谱方法对于去除色素不太理想，因此该工艺产品在外观颜色和溶液吸光度上不是十分理想。专利WO2006061166中的实例采用粒径5um的反相硅胶（Octadecylsilicagel）作为色谱介质，含5mM醋酸铵且pH调节为4.0的3%甲醇溶液作为流动相，在流动相中加入2%的戊醇作为解析剂，收集色谱纯度大于97.5%的盐酸万古霉素，然后通过真空浓缩收集液浓度至140mg/ml，加入甲醇，用氨水调节pH8.5-9.0，冷却料液温度至0度，分离沉淀物，并用甲醇顶洗，将分离物用水溶解并调节pH至3.2，然后用异丙醇进行结晶，真空烘干，最终得到纯度达到97-99.3%的盐酸万古霉素成品。该专利所涉及的工艺存在一些缺陷，尤其对于商业化扩大生产有一定的难度，首先，该方法中流动相和洗脱剂使用了不同溶剂，对于溶剂回收存在一定的困难；其次，由于该工艺通过反相纯化，色谱纯度并不能一次性达到99%以上，因此需要有两步溶剂结晶操作，最后通过真空干燥获得成品，而溶剂结晶存在的普遍问题是残留溶剂不能有效去除，达不到ICH对残留溶剂的要求；最后，该方法由于步骤较多，在产品收率上并不理想。因此，从目前的文献资料看，由于存在种种的缺陷，市面上还没有一种制备高纯度（色谱纯度达到99%以上）的适用于商业化生产的盐酸万古霉素生产方法，而鉴于盐酸万古霉素用药安全性，需要一种制备高纯度盐酸万古霉素的方法。
技术实现思路
本专利技术提供了一种高纯度（色谱纯度达到99%以上）、低杂质、高效率的适用于商业化生产的盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述分离纯化方法包括如下步骤：（1）万古霉素粗品通过离子色谱交换层析法制备得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩，得到第一盐酸万古霉素浓缩液；（2）用盐酸溶液调节第一盐酸万古霉素浓缩液pH=3.5-4.5，再将调节后的第一盐酸万古霉素浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析，其中，固定相为C18硅胶或聚苯乙烯聚合物，流动相为含有铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶液；（3）收集万古霉素B含量大于98.5%的层析液；（4）用盐酸调节上述层析液pH=2.5-3.5，再用纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到第二盐酸万古霉素浓缩液；以及（5）将步骤（4）的第二盐酸万古霉素浓缩液精制脱水以得到色谱纯度达到99%，纯白的盐酸万古霉素粉。优选地，步骤（1）中所述盐酸万古霉素溶液为通过离子交换色谱层析法获得的万古霉素色谱纯度大于95%的盐酸万古霉素溶液。上述制备万古霉素色谱纯度不低于95%的盐酸万古霉素溶液是通过如下现有技术方法制得。（1）首先，按照中国专利CN01132048.6所述的方法，采用发酵菌种为东方拟无枝酸（AmycolatopsisOriertalis）SIPI43491，经过接种体的培养，接种至一级种子罐，经二级种子扩大培养后，进入发酵罐培养，控制温度24-34℃，培养压力0.01-0.08MPa，过程中控制溶解氧和pH，发酵周期为4-6天，得到万古霉素发酵液。（2）其次，按照中国专利CN200710198599.4所述，将万古霉素发酵液通过大孔吸附树脂，用含乙醇的酸性水溶液将万古霉素洗脱，然后在洗脱液中加入活性炭脱色，在脱色液中加入碳酸氢铵，并用氨水调节pH至7.5-8.5搅拌静置后分离得到色谱纯度不低于80%的万古霉素粗品（该万古霉素粗品指的是步骤（1）中的万古霉素粗品）。（3）万古霉素粗品在纯化水里溶解后用0.01～0.5μm孔径的陶瓷膜过滤，获得澄清的万古霉素滤液。澄清万古霉素滤液经过离子交换层析柱层析纯化得到万古霉素B含量95%以上的有效层析液（即，万古霉素色谱纯度不低于95%的盐酸万古霉素溶液）。这里，所说的离子交换层析柱所用填料阳离子交换葡聚糖凝胶（Sephadex）或琼脂糖凝胶（Sepharos本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高纯度盐酸万古霉素的分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：（1）万古霉素粗品通过离子交换色谱层析法制备得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩，得到第一盐酸万古霉素浓缩液；（2）用盐酸溶液调节第一盐酸万古霉素浓缩液pH=3.5‑4.5，再将调节后的第一盐酸万古霉素浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析，其中，固定相为C18硅胶或聚苯乙烯聚合物，流动相为含有铵盐的甲醇水溶液或乙醇水溶液；（3）收集万古霉素B含量大于98.5%的层析液；（4）用盐酸调节上述层析液pH=2.5‑3.5，再用纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到第二盐酸万古霉素浓缩液；以及（5）将步骤（4）的第二盐酸万古霉素浓缩液精制脱水以得到色谱纯度达到99%，纯白的盐酸万古霉素粉。

【技术特征摘要】
1.一种盐酸万古霉素B的分离纯化方法，所述方法包括下列步骤：(1)万古霉素粗品通过离子交换色谱层析法制备得到盐酸万古霉素溶液，并通过纳滤脱盐浓缩，得到第一盐酸万古霉素浓缩液；其中，所述离子交换色谱层析法中的离子交换色谱层析的填料为葡聚糖凝胶SephadexCM-25，洗脱液为NH4HCO3；(2)用盐酸溶液调节第一盐酸万古霉素浓缩液pH＝3.5-4.5，再将调节后的第一盐酸万古霉素浓缩液通过反相色谱层析柱进行柱层析，其中，固定相为聚苯乙烯聚合物，流动相为乙醇水溶液；所述流动相采用5％(V/V)乙醇水溶液进行预洗，然后所述流动相采用10％(V/V)乙醇水溶液进行洗脱；(3)收集万古霉素B含量大于98.5％的层析液；(4)用盐酸调节上述层析液pH＝2.5-3.5，再用纳滤浓缩脱除溶剂和盐，以得到第二盐酸万古霉素浓缩液；以及...

【专利技术属性】
技术研发人员：李恩民，庄逸云，王珏，孙新强，劳学军，江必旺，
申请(专利权)人：浙江医药股份有限公司新昌制药厂，
类型：发明
国别省市：浙江;33