重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。该方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及带有胰腺ela-荧光筛选标签和Cas9靶标片段的供体载体，2)在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；4)G0代胚胎通过胰腺ela-荧光标签进行筛选，并对F1进行southern blot鉴定。本发明专利技术为利用爪蛙为模式动物研究遗传学和研究人类疾病奠定基础。

【技术实现步骤摘要】
重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种重组后不产生移码突变的载体、在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用。
技术介绍
非洲爪蛙(Xenopuslaevis)是一种早期胚胎学研究的经典模式动物。有胚胎个体大，产卵量多等优点。热带爪蛙(Xenopustropicalis)具备非洲爪蛙的全部优点，另外该物种个体较小，繁殖周期短(4-5个月)，并且是二倍体品种，适合做遗传学研究。热带爪蛙全基因组测序已完成，其基因组有约17亿个碱基对，包含2万至2.1万个基因，其中约1700个基因与人类相应的基因非常相似，所有人类基因中近80％的与遗传性疾病有关的基因都可在热带爪蟾的基因中找到对应处(Hellstenetal.，2010)。而这些基因与癌症、哮喘、心脏病等疾病的发病有关。所以，热带爪蛙是一个很好的研究基因功能，寻找疾病相关因子，建立遗传疾病，建立大规模药物筛选的理想模型。以前，爪蛙通过mRNA注射达到基因过表达的目的，用morpholino注射达到基因敲降的目的。但是这两种方法都具有时效性，不能长期做遗传学研究。20世纪末期，科学家用基因同源重组技术完成了基因敲除与定点修饰，这种方法由于效率极低(Thomasetal.，1987)，对生命科学的研究帮助仅局限于有胚胎干细胞与体细胞核移植技术成熟的物种。随着人们对生物学的进一步了解，发现DNA双链断裂可以有效的提高基因定点修饰的效率(Jasin.，1996)，基于此，近年来，随着能造成基因组定点双链断裂的工具，如ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9等的不断兴起，目前已成功地在多种物种的胚胎水平进行基因敲除与基因定点修饰。利用基因打靶技术(ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9)在热带爪蛙和非洲爪蛙中，通过基因双链断裂后的非同源末端修复，造成移码突变，达到特定基因功能缺失的目的，实现了基因的定点破坏(Youngetal.，2011；Leietal.，2012；Ishibashietal.，2012；Nakayamaetal.，2013；Blitzetal.，2013；Guoetal.，2014)，使得爪蛙在探索生物机制与生物医药中的作用大大增加。但是，在研究中，仅仅特定基因功能缺失存在很大的局限性，在大多数研究中，我们需要进行基因的时空表达调节与标记，定点突变相关因子建立人类疾病模型等。这时，我们需要对内源基因的某些位点进行精确的定点修饰与编辑。所以，在爪蛙中实现基于重组的基因定点修饰是非常重要的。目前，在基因定点敲入修饰中，出现的各种技术主要可以分为两类。1.由同源重组机制介导的基因定点修饰。这种技术通过模板的不同主要分为双链质粒模板，线性化质粒模板，单链模板介导的同源重组介导的基因定点修饰。其缺点是：对同源臂要求高，效率低，并且繁琐。2.由非同源末端连接机制介导的基因定点修饰。这种技术最近兴起，分别在细胞水平，模式动物斑马鱼中完成了基因定点修饰。但在斑马鱼中存在不在读码框内的现象(Aueretal.，2014)，使得效率降低2/3。最近，在非洲爪蛙中利用非同源末端连接机制介导的基因定点修饰技术实现了基因定点修饰(Nakadeetal.，2014)。但是，该文章数据显示，这种修饰没有经过生殖腺进行传递的信息，并且局限于表达强度高的基因。对于表达弱的基因或lncRNA是无法进行插入筛选。所以，在热带爪蛙中实现高效、精确、可筛选、可遗传的基因定点敲入技术是非常重要的。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法及应用、一种在发生重组后不产生移码突变的载体及应用、和一种用于在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的试剂盒。第一方面，本专利技术提供了一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，所述方法包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。如本专利技术所述的，″向导RNA″与″gRNA″互用。如本专利技术所述的，″供体载体″与″donor载体″互用。如本专利技术所述的，如现有文献记载的，所述向导RNA依次由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和骨架RNA片段连接而成；所述骨架RNA片段依次由tracrRNA、crRNA嵌合形成类似发夹结构的RNA，所述骨架RNA片段可与Cas9核酸酶结合，所述Cas9核酸酶带有核定位信号肽，本专利技术中，所述骨架RNA片段、Cas9核酸酶均为行业内常用序列。在本专利技术一实施例中，所述骨架RNA片段为由SEQUENCENO.1所示核苷酸所示DNA转录出来的。在本专利技术一实施例中，所述向导RNA中，能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段为如SEQUENCENO.2(ets1：GGTTCAGAGAATTCAGAGGG)；SEQUENCENO.3(ets2：GGTCTGGACTCTTACTCTCA)；或SEQUENCENO.4(tyr：GGGGTCCCTAACTTCCTCTA)所示DNA转录出来的。在本专利技术一实施例中，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因核苷酸序列如SEQUENCENO.5所示。如本专利技术所述的，如现有文献记载的，所述双链Cas9靶标片段中的一条链具有如下结构：5’-Nx-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，18≤X≤22，但不限于此。在本专利技术一优选实施例中，所述5’-GG-Nx-NGG-3’中，X＝18。在本专利技术一实施例中，所述步骤1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中直接注射所述向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体。在本专利技术另一实施例中，所述步骤1)中，所述使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为：向爪蛙受精卯中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卯中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卯中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。在本专利技术一实施例中，所述步骤(1)中，向爪蛙受精卯中进行注射时，采用显微注射，并且在受精卯未卯裂之前，注射于受精卯动物极区域。在本专利技术一实施例中，所述步骤(1)中，所述供体载体还包括荧光报告基因表达盒，所述荧光报告基因表达盒采用胰腺启动子。在该实施方式中，本专利技术第一方面所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，所述方法优选为包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于，所述方法包含以下步骤：1)使爪蛙受精卯中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段。

【技术特征摘要】
1.一种在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，是利用CRISPR/Cas系统在爪蛙中对目的基因进行改造，该系统包括向导RNA和Cas9核酸酶，其特征在于，所述方法包含以下步骤:1)使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体，2)然后在向导RNA和Cas9核酸酶共同作用下，爪蛙基因组中目的基因中以及供体载体上的双链Cas9靶标片段被剪切，3)再通过爪蛙细胞的自身DNA修复功能，实现在爪蛙基因组中的基因定点敲入；其中，所述向导RNA包括与所述Cas9靶标片段互补结合的RNA片段；所述供体载体包括Cas9靶标片段和待敲入的基因；所述爪蛙基因组中的目的基因包括Cas9靶标片段；所述向导RNA中，与所述靶标片段互补结合的RNA片段为如SEQUENCENO.2、SEQUENCENO.3或SEQUENCENO.4所示DNA转录出来的；所述步骤(1)中，所述供体载体还包括爪蛙基因组的内含子序列和外显子序列，所述供体载体中，所述Cas9靶标片段位于所述内含子序列中，所述内含子序列、外显子序列和待敲入基因依次连接；所述内含子序列和外显子序列总长度为如SEQUENCENO.9、SEQUENCENO.10或SEQUENCENO.11所示的核苷酸序列。2.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述双链Cas9靶标片段中的一条链具有如下结构:5’-Nx-NGG-3’，N表示A、G、C和T中的任一种，18≤X≤22。3.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为:向爪蛙受精卵中直接注射所述向导RNA、带有核定位信号肽的Cas9核酸酶以及供体载体。4.如权利要求1所述的在爪蛙基因组中进行基因定点敲入的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述使爪蛙受精卵中含有向导RNA、Cas9核酸酶以及供体载体的方法为:向爪蛙受精卵中导入含有所述向导RNA的表达盒的重组克隆载体和含有所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的编码基因的重组表达载体以及供体载体，所述向导RNA的表达盒在爪蛙受精卵中表达出向导RNA，所述带有核定位信号肽的Cas9核酸酶的表编码基因在爪蛙受精卵中表达出带有核定位信号肽的Cas9核酸酶。5.如...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈永龙，石照应，
申请(专利权)人：中国科学院广州生物医药与健康研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44