一种抑制肠道病毒71的药物制造技术

本发明专利技术提供了一种抑制肠道病毒71的药物。本发明专利技术发现临床上用于治疗真菌感染的两性霉素B具有抑制肠道病毒71的特性，通过药物毒性试验、药物对病毒的抑制试验、病毒斑块形成试验，发现两性霉素B可明显抑制EV71病毒在RD细胞和293细胞中的感染，进一步发现两性霉素B是通过影响EV71病毒的吸附起到抵抗该病毒感染的作用。本发明专利技术为肠道病毒71的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种抑制肠道病毒71的药物
本专利技术涉及抗病毒药物领域，具体地，涉及一种抑制肠道病毒71的药物。
技术介绍
手足口病在世界多个地区,尤其是亚洲爆发并流行,且其感染率和死亡率逐年增高,危害十分严重。肠道病毒71(Enterovirus71,EV71)是手足口病(Hand,foot,andmouthdisease,HFMD)的主要病原体,以感染婴幼儿为主,其感染常伴随神经系统并发症,严重可导致儿童死亡。目前,虽有一些针对EV71复制周期抗病毒药物、EV71的疫苗开发、RNA等方面的报道,但迄今为止,还没有找到行之有效的预防措施及治疗方法。为了找到EV71感染的有效治疗方法,目前,国内外学者在药物研发方面已经取得了一些研究成果。一是利用现有的抗病毒药物治疗手足口病；二是依据EV71的分子生物学特点设计并合成现有抗病毒药物的衍生物；三是筛选新的抗EV71的药物。但是现今取得的抗EV71成果大多停留在实验室阶段,能否被应用于临床治疗,还有待深入的研究。目前抗EV71的药物主要包括以下几种：受体结合阻断剂、病毒衣壳阻断剂、酶抑制剂和核苷类似物等。研究发现EV71的受体不只一种，包括清道夫受体B2(HumanscavengerreceptorclassB,member2,SCARB2)、P选择素糖蛋白配体(HumanP-selectinglycoproteinligand-1,PSGL-1/CD162)等。抗SCARB2抗体和可溶的SCARB2结合剂能够阻止EV71的侵入。可溶性的PSGL-1单克隆抗体和纯化的唾液酸多糖也能阻断EV71的感染。但在EV71滴度较高的情况下,这些受体结合阻断剂都不能有效的抑制感染,这可能与EV71存在多种细胞受体有关。因此,只针对一种受体的抑制剂不能彻底抑制病毒的感染。普拉康纳利(Pleconaril)是一种病毒衣壳阻断剂，能够通过与病毒的蛋白衣壳结合而干扰病毒的吸附和脱壳，是一类广谱的抗微小核糖核酸病毒药物。其咪唑啉酮衍生物，能够抑制EV71在横纹肌肉瘤(Rhabdomyosarcoma,RD)细胞中引起的病变效应且细胞毒性较低。蛋白酶是微小核糖核酸病毒属病毒复制所必需的特异蛋白酶之一。芦平曲韦(Rupintrivir)是根据鼻病毒3C结构设计的抗病毒物质。Kuo等根据芦平曲韦设计了一系列衍生物，作为EV71蛋白酶3C抑制剂进行了验证。最终发现，其衍生物10b是一种有前景的抑制剂，并且没有明显的细胞毒性，但其在体内是否仍然具有抗病毒活性有待于进一步验证。随着EV71分子生物学研究的深入,已经针对EV71复制过程中不同靶点设计了诸多抗病毒药物,但对其在体内的抗病毒效应及不良反应等大多还需进一步的体内试验和临床验证。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种抑制肠道病毒71的药物。两性霉素B(AmphotericinB)，是从链霉菌中分离而来的一种多烯类抗真菌抗生素，其结构中含有一羧基和一氨基，故兼有酸碱两性，对多种真菌如新型隐球酵母、皮炎芽酵母、巴西芽酵母、荚膜组织胞浆菌、申克氏侧孢霉、白假丝酵母和若干诺卡氏菌等有显著的抑菌作用。被称为治疗深部真菌感染的“金标准”，耐药率低、抗菌谱广。该药物已广泛应用于抗真菌感染的临床治疗中。本专利技术经过大量试验研究发现临床上用于治疗真菌感染的两性霉素B具有抑制肠道病毒71的作用。因此本专利技术提供一种抑制肠道病毒71的药物，含有多烯类抗真菌抗生素。进一步，所述多烯类抗真菌抗生素为两性霉素B或其衍生物。本专利技术提供的抑制肠道病毒71的药物还含有药学上可接受的辅料。上述药物与医学上可接受的载体或赋形剂制成的药物制剂也属于本专利技术的保护范围。所述制剂为片剂、胶囊剂、粉针剂、喷雾剂或颗粒剂。本专利技术还提供了两性霉素B或其衍生物在制备抑制或治疗肠道病毒71药物中的应用。本专利技术通过药物毒性试验、药物对病毒的抑制试验、病毒斑块形成试验，发现0.5μM的两性霉素B可明显抑制EV71在293中的感染，在293细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为0.32μM；2μM的两性霉素B可抑制EV71在RD细胞中的感染，在RD细胞中两性霉素B抵抗EV71的半数抑制浓度为1.74μM。本专利技术进一步发现两性霉素B是通过影响EV71病毒的吸附起到抵抗该病毒感染的作用。本专利技术为肠道病毒71的预防和治疗提供了新的药物，具有较好的市场价值和临床应用前景。附图说明图1为EV71感染两性霉素B处理的RD细胞后病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。图2为EV71感染两性霉素B处理的293细胞后病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。图3为EV71感染两性霉素B处理的RD细胞的不同时间后病毒蛋白的表达情况，用针对EV71的抗体及病毒结构蛋白VP1的抗体指示病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。图4为EV71感染两性霉素B处理的293细胞的不同时间后病毒蛋白的表达情况，用针对EV71的抗体及病毒蛋白VP1的抗体指示病毒蛋白的表达情况，持家基因Actin的表达作为对照。图5为两性霉素B处理影响EV71的吸附。用针对EV71VP1的特异性引物指示病毒的吸附及进入量，持家基因GAPDH的表达作为对照。图5A为PCR结果，图5B为实时定量PCR的结果。图6为RD细胞中不同浓度两性霉素B抑制EV71感染的情况。图7为293细胞中不同浓度两性霉素B抑制EV71感染的情况。图8为RD细胞中不同浓度两性霉素B的细胞毒性。图9为293细胞中不同浓度两性霉素B的细胞毒性。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本专利技术实施例中使用的两性霉素B，购自Sigma公司，溶于DMSO中。EV71病毒株为安徽阜阳株，由中国医学科学院病原生物学研究所分离得到，将病毒在人恶性胚胎横纹肌肉瘤细胞(RD)中扩增，取上清，分装后-70℃保存。RD细胞及感染用293细胞用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃，5％CO2培养箱中培养，每2-3天传代一次。实施例1药物对EV71的抑制实验1、方法RD细胞(8×105)或293细胞(6×105)接种在六孔板无抗生素DMEM完全培养基中，培养过夜，细胞生长平铺90％以上时，RD细胞加入0、1、2、3、4、5μM的两性霉素B处理细胞，2h后分别加入MOI：0.08的EV71进行感染。293细胞加入0、0.2、0.5、1、2、3μM的两性霉素B处理细胞，2h后分别加入MOI：0.5的EV71进行感染。在培养箱中孵育1h后换成正常培养基培养相应时间，收集上清，进行病毒斑块形成试验。同时收集细胞，裂解后进行WesternBlotting实验，检测细胞中病毒蛋白的表达情况。1.1病毒斑块形成实验RD细胞(3×105)接种于12孔板中，待细胞平铺90％以上时，将收集的病毒上清10倍梯度稀释，感染细胞1h后，弃去病毒，覆盖37℃预温含1％低熔点琼脂糖的DMEM维持培养基继续培养2-3天后，用4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抑制肠道病毒71的药物，其特征在于，含有多烯类抗真菌抗生素。

【技术特征摘要】
1.仅以两性霉素B为有效成分的原料在制...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭斐，
申请(专利权)人：中国医学科学院病原生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11