一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术通过在天冬酰胺酶的N端融合pelB信号肽，使重组菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，进一步共表达lepB信号肽酶，可将天冬酰胺酶酶活在此基础上提高1.45倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。

【技术实现步骤摘要】
一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法
本专利技术涉及一种提高L-天冬酰胺酶分泌表达的方法，属于基因工程领域。
技术介绍
L-天冬酰胺酶(EC3.5.1.1)是一种有抗癌活性的蛋白酶，能专一催化L-天冬酰胺水解成天冬氨酸和NH3。L-天冬酰胺酶的生理作用主要表现为对某些肿瘤的抑制作用，尤其对急性白血病和恶性淋巴肿瘤有效。L-天冬酰胺酶已成为治疗白血病非常有效的药物，对骨髓细胞没有抑制作用。L-天冬酰胺酶可以减少食物中丙烯酰胺的生成。丙烯酰胺主要是由食品原料中的还原糖和天冬酰胺在高温加热过程中通过美拉德反应生成，在食物中加入天冬酰胺酶可以水解天冬酰胺，从源头上减少丙烯酰胺的生成。一些微生物、哺乳动物及植物被证实含有L-天冬酰胺酶。因为动物血清中L-天冬酰胺酶含量低，且提取工艺复杂，微生物具有易培养，成本低等优点，成为学者研究的重点，目前研究的产L-天冬酰胺酶微生物主要包括Escherichiacoli、Erwiniacarotovora、Erwiniachrysanthemi等，但野生菌株L-天冬酰胺酶产量低，近年来利用基因工程技术将L-天冬酰胺酶基因克隆到大肠杆菌中，获得L-天冬酰胺酶的高效表达，利用工程菌产L-天冬酰胺酶已成为一个重要来源。本专利技术通过在大肠杆菌中共表达带有信号肽的天冬酰胺酶及信号肽切割酶lepB，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。
技术实现思路
本专利技术首先要解决的问题是提供一种提高天冬酰胺酶分泌表达的方法，是将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因在大肠杆菌中进行共表达，得到了天冬酰胺酶分泌能力提高的菌株。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述信号肽的基因如SEQIDNO.1～8任一所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽是pelB。在本专利技术的一种实施方式中，所述天冬酰胺酶来源于枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQIDNO.10所示。在本专利技术的一种实施方式中，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b(+)连接，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；将信号肽酶基因lepB连接pRSF-duet(+)，转化上一步得到的重组菌。挑选转化子接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％。菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，分离得到天冬酰胺酶。本专利技术要解决的另一个技术问题是提供一种胞外分泌天冬酰胺酶能力增强的重组菌，是将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因转化大肠杆菌进行共表达得到的。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述信号肽的基因如SEQIDNO.1～8任一所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述信号肽是pelB，编码pelB的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述天冬酰胺酶来源于枯草芽孢杆菌。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQIDNO.9所示。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQIDNO.10所示。在本专利技术的一种实施方式中，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。在本专利技术的一种实施方式中，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b(+)连接，转化大肠杆菌Rosetta(DE3)；将信号肽酶基因lepB连接pRSF-duet(+)，转化上一步得到的重组菌，筛选得到阳性转化子。本专利技术还提供一种应用所述胞外分泌天冬酰胺酶能力增强的重组菌发酵生产天冬酰胺酶的方法，是将重组菌接种到LB液体培养基中，37℃培养12h，转接到TB培养基中，接种量为3％；菌体长到OD600为1.5时，加入IPTG诱导，并将培养温度降到30℃，培养24h。收集发酵上清，分离得到天冬酰胺酶。本专利技术通过在天冬酰胺酶的N端融合pelB信号肽，使重组菌的胞外天冬酰胺酶酶活提高了20倍，进一步共表达lepB信号肽酶，可将天冬酰胺酶酶活在此基础上提高1.45倍。改造后的菌株产酶能力显著提高，更适合工业应用，可降低生产成本，提高生产效率。附图说明图1融合表达不同信号肽对胞外天冬酰胺酶产量的影响图2共表达信号肽酶对胞外天冬酰胺酶产量的影响图3天冬酰胺酶生产菌株蛋白电泳图；1：Marker，2：R20b-pelB胞外，3：R20b-pelB/pRSF-duet-lepB胞外，4：R20b-pelB胞内，5：R20b-pelB/pRSF-duet-lepB胞内。具体实施方式LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl10g/L，pH7.0。TB培养基：蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L，甘油8g/L，17mmol/LKH2PO4，72mmol/LK2HPO4。采用分光光度法测定天冬酰胺酶酶活，1个单位天冬酰胺酶酶活定义为：酶活定义：在37℃反应条件下，每分钟内能催化L-天冬酰胺释放1μmolNH3所需要的酶量为一个酶活单位(U/ml)。酶活测定条件：37℃条件下，1ml10mMK2HPO4-KH2PO4(PH7.5)，0.1ml189mM天冬酰胺，0.3ml发酵上清液，保温30分钟，0.1ml1.5MTCA终止反应。利用ShimadzuUV-1240在436nm处测定吸光值，通过硫酸铵绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。实施例1天冬酰胺酶基因融合信号肽信号肽pelB的核苷酸序列：ATGAAATACCTGCTGCCGACCGCTGCTGCGGTCTGCTGCTCCTCGCTGCCCAGCCGGCGATGGCC信号肽ompA的核苷酸序列：ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCGCTCCG信号肽torT的核苷酸序列：ATGCGCGTACTGCTATTTTTACTTCTTTCCCTTTTCATGTTGCCGGCATTTTCGGCTGAT信号肽TorA的核苷酸序列：ATGAACAATAACGATCTCTTTCAGGCATCACGTCGGCGTTTTCTGGCACAACTCGGCGGCTTAACCGTCGCCGGGATGCTGGGGCCGTCATTGTTAACGCCGCGACGTGCGACTGCGGCGCAAGCG信号肽sufI的核苷酸序列：ATGTCACTCAGTCGGCGTCAGTTCATTCAGGCATCGGGGATTGCACTTTGTGCAGGCGCTGTTCCCCTGAAGGCCAGCGCAGCCGGG信号肽D本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高天冬酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因在大肠杆菌中进行共表达。

【技术特征摘要】
1.一种提高天冬酰胺酶分泌表达的方法，其特征在于，将信号肽融合至天冬酰胺酶的N端，将编码该融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与信号肽切割酶基因在大肠杆菌中进行共表达；编码所述信号肽的基因如SEQIDNO.1所示；编码所述天冬酰胺酶的基因序列如SEQIDNO.9所示；编码所述信号肽切割酶的基因序列如SEQIDNO.10所示。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以载体pET-20b(+)表达编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以载体pRSF-duet(+)表达编码信号肽切割酶的基因。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以大肠杆菌Rosetta(DE3)为宿主。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将含有编码融合有信号肽的天冬酰胺酶的基因与载体pET-20b...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，阮洁，冯岳，陈坚，堵国成，黎清华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32