用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法技术

本发明专利技术提供了用于实现在生理条件下快速可逆的低抗体亲抗原性、高亲和力和高特异性的生物分子相互作用的组合物和方法。所述方法包括使生物靶标(诸如分子、蛋白质、DNA、细胞等)与聚合物和抗聚合物配体连接以及使用生理上相容的聚合化合物来逆转它们结合的方法。所述方法还包括对用于正交标记的不同聚合物/抗聚合物系统进行组合的方法。所述组合物包含包括与聚合物缀合的颗粒(荧光、磁性、致密等)的标记或与抗聚合物抗体缀合的标记。所述组合物还包含与所述聚合物缀合的生物分子(蛋白质、抗体、DNA等)。这些方法和组合物展示出对现有技术的重大改进。它们特别可用于使用颗粒来分离和隔离生物靶标，对包括荧光成像在内的其它领域具有重要应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法专利
本专利技术涉及用于将样品中的生物靶标与其标记快速分离的方法和组合物。专利技术背景生命科学和医学领域中的许多不同应用需要对生物靶标(诸如分子、DNA、蛋白质或细胞)进行特异性标记。标记提供使用标记的新的功能或物理特性(荧光、磁性、密度、酶活性、放射性等)对来自复杂生物样品内的靶标进行检测或操纵的灵敏方法。例如，荧光标记能够使生物靶标(在某些情况下以分子灵敏的程度)可视化。荧光技术正在革新从研究工作台到临床的许多生物学领域。同样地，磁性标记能够实现使用磁共振成像(MRI)或医学颗粒成像(MPI)技术(均为当前重要的临床诊断手段)对生物靶标进行成像。磁性标记的另一个重要应用是用于使用磁场从复杂样品中分离和纯化生物靶标(主要是DNA、蛋白质或细胞)。磁性标记和分离已被广泛应用，并革新了细胞分离领域。细胞分离涉及在细胞物理或功能特性基础上从复杂生物样品(血液、组织、骨等)中分离特定细胞类型。荧光激活细胞分选(FACS)是一种在用荧光抗体标记后细胞受体表达的基础上分离所述细胞的流式细胞术形式。然而，FACS的缺点是分离费时且产量低。对于磁性分离，通常利用蛋白质或抗体的亲和结合特性(通常称为免疫标记的方法)使磁性微粒或纳米颗粒靶向细胞受体。缀合到抗体或蛋白质的磁性微粒或纳米颗粒用于选择性地靶向复杂的生物样品内的细胞。阳性选择是所需细胞类型被颗粒直接标记并通过磁性洗涤分离的常用方法。相反，对于阴性选择(或贫化/富集)，不需要的细胞类型被颗粒标记并通过施加磁场而去除，以未标记的形式分离所需细胞。阳性选择的优点是分离的细胞通常比阴性选择的纯度更高，但缺点是它们具有结合到其表面上的颗粒。阴性选择使得所需细胞保持未被标记，但缺点是纯度通常比阳性选择更低，并且需要混合多个抗体以标记不想要的细胞。阳性和阴性免疫磁性细胞分离策略是目前众多商用产品支持的完善技术。这些产品通常采用缀合到一级或二次抗体、缀合到链霉亲和素以与生物素化的抗体一起使用或缀合到葡聚糖以与四聚体抗体复合物(TAC)一起使用的磁性颗粒。细胞分离领域目前要求更快还更复杂的策略以从相同样品中分离多种细胞类型、以分离不容易由其受体表达定义的细胞亚群，并且要求改进的策略用于分离非常罕见的细胞类型，在所有这些的同时保持细胞天然或接近天然状态。对于免疫磁性技术，分离多种细胞类型或不由单一受体表达定义的细胞类型的方法是采用阳性或阴性选择和正交标记技术的组合。大多数连续分离应用，特别是涉及多个阳性选择或阳性选择随后阴性选择的那些应用，要求在第一轮分离后从细胞表面有效去除磁性标记，而不损害细胞的活力或回收率(产率)。即使对于简单的阳性选择，非常需要以去除颗粒的方式来减轻颗粒对细胞的功能或活力的干扰。已知的是微粒或纳米颗粒可以通过不同的方法内化到细胞中，这取决于颗粒表面的物理和化学特性以及具体的细胞类型(VermaandStellacci2010)。除了细胞功能，细胞表面上的颗粒可干扰许多下游测定。例如，在流式细胞术分析过程中，当颗粒存在时细胞的粒度测量(侧向散射)向较大的值偏移，这使识别特定细胞群变得复杂。在细胞表面上具有颗粒的另一缺点是，氧化铁可以淬灭荧光信号，从而降低了在分离的细胞上进行免疫荧光测定的灵敏度。从临床前和临床观点来看，如果要将分离的细胞用于包括细胞治疗应用的人类研究中，那么重要的是细胞呈其天然或接近天然形式、不含杂质和颗粒、具有高功能性和活性。温和地从细胞表面去除颗粒仍然是一个挑战，因为免疫细胞分离领域的技术人员知道，高亲和力抗体/抗原或蛋白质相互作用(KD～1-100nM)需要将颗粒和细胞连接一起。此类高亲和力相互作用能够在若干轮磁性洗涤下以高纯度和产率分离细胞，但通常仅在对细胞有破坏性的溶液条件下逆转。在过去的20年中，已经提出许多不同方法以从细胞中去除颗粒，但许多方法损伤细胞、降低活力、改变功能特性或者它们过于复杂和费时。这些策略中的一些包括将细胞在培养基中过夜温育、改变pH、温度、盐、加入还原剂来裂解抗体，或使用机械剪切力来破坏来自细胞表面的颗粒。美国专利号5,081,030描述了使用消化酶如木瓜蛋白酶从细胞去除颗粒的方法。同样，欧洲专利号EP0819250B1描述了使用糖苷酶来释放颗粒的方法。一旦抗体缀合的颗粒已经靶向细胞并且细胞被磁性纯化，则将酶加至细胞悬液中以消化参与颗粒细胞连接的蛋白质、抗体或多糖。此方法的缺点是，酶的成本高昂，它们在储存过程中容易分解，所述方法是费时的，而且某些酶通过消化细胞表面蛋白而改变细胞功能。Werther等(Werther,Normark等2000)描述了链霉亲和素-生物素系统与裂解DNA接头的联合使用。为去除来自选定细胞的颗粒，将悬浮液用DNase酶温育。此构思是来自Dynal的磁性细胞分离的CELLection产品线的基础。所述方法的优点在于，所述酶对DNA接头具有特异性，但它具有先前提到的基于酶的系统的缺点。美国专利号5,429,927描述了使用二次抗体来破坏抗体缀合的颗粒与其细胞表面的受体的相互作用以从细胞去除颗粒的方法。在一种形式中，所述二次抗体是直接与一次抗体结合从而诱导构象改变并释放所述颗粒的多克隆抗Fab。此方法是来自Dynal的DETACHaBEAD颗粒去除系统的基础，并且也已被Rasmussen等(Rasmussen,Smeland等1992)和Geretti等(Geretti,VanEls等1993)描述。此方法的缺点是，它对于最终使用者是费时的(～45-60分钟方法)，对于高效颗粒释放要求高浓度的二次抗体，并且根据一次抗体的克隆和种类需要独特的二次抗体。美国专利号5,773,224描述了肝素/抗凝血酶III用于以列形式的阳性选择和细胞洗脱。所述方法使用与肝素缀合的固相柱，装载生物素化的抗凝血酶III，并随后通过抗生物素蛋白交联。使用所需细胞类型的一次抗体和生物素化的二次抗体来选择细胞。通过增加固相细胞相互作用的抗体亲抗原性(avidity)的抗生物素蛋白交联来提高抗凝血酶III对于肝素的中等亲和力。当在分离结束加入游离的可溶性肝素时，它竞争抗凝血酶III结合位点并从柱释放细胞。逆转是有效的，因为单个肝素/抗凝血酶III相互作用弱到足以被直接竞争破坏。所述方法的缺点是，需要交联剂来提高标记的性能，因为它使细胞分离过程变得复杂。另一个缺点是，此方法限于肝素/抗凝血酶III，因为肝素是血液中常见的抗凝血剂，所述方法不包括处理这些类型的样品。美国专利号5,985,658描述了使用钙调蛋白和钙调蛋白结合肽之间的可逆相互作用从细胞中去除颗粒的方法。将细胞用所需细胞类型的一次抗体、随后用肽缀合的二次抗体和钙调蛋白缀合的颗粒标记。蛋白和肽通过钙离子桥结合。颗粒去除通过加入去除离子并逆转结合的EGTA螯合剂而触发。美国专利号6,017,719描述了使用工程化的肽来置换来自细胞表面的抗体缀合的磁性颗粒的方法。肽结合至靶向抗体，并且通过竞争结合位点或引起抗体构象变化而从细胞表面置换它们。所述方法的主要缺点是必须合理设计并选择用于将颗粒靶向细胞的每个抗体的独特的肽。生物素和链霉亲和素或抗生物素蛋白具有极高的亲和力(～fM)，并且通过生物素化的抗体和链霉亲和素或抗生物素蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：1)通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物结合的配体；和2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.23 US 61/692,422;2013.03.14 US 61/781,6511.一种将样品中的生物靶标与标记分离的方法，其包括：1)通过连接系统使所述生物靶标与所述标记结合，所述连接系统包含第一聚合物和与所述第一聚合物可逆结合的配体；和2)向所述样品中加入第二聚合物以将所述生物靶标与所述标记分离。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物对于所述配体具有相似的亲和力。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至与第一聚合物结合的配体的所述生物靶标结合的配体和与所述第一聚合物缀合的标记。4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述连接系统包含与连接至第一聚合物的所述生物靶标结合的配体和与结合到所述第一聚合物的配体缀合的标记。5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物基本上由均聚物区域组成。6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是亲水性的或两亲性的。7.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物由相同或相似的单体组成。8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物独立地选自PEG、PEG衍生物、聚羧基甜菜碱-、葡聚糖、淀粉、肝素、几丁质、纤维素、肽和核酸。9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一聚合物是PEG、PluronicF68和吐温20。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物选自由PEG、PluronicF68和吐温20组成的组。11.根据权利要求9所述的方法，其中所述第二聚合物是PluronicF68。12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述第二聚合物的浓度为至少0.10％w/v。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二聚合物的浓度为至少0.25％w/v。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第二聚合物的浓度为至少1.0％w/v。15.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是葡聚糖。16.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一聚合物和所述第二聚合物是多组氨酸(pHIS)。17.根据权利要求1-2、10-11和15-16中任一项所述的方法，其中所述标记选自固体载体、荧光蛋白和染料、抗体、酶、功能蛋白、肽或生长因子和放射性标签或元素标签。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述标记是选自颗粒、表面和柱的固体载体。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述标记是选自纳米颗粒、微粒、微球或珠的颗粒。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述颗粒是磁性颗粒、致密颗粒或荧光颗粒。21.根据权利要求3所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体，并且结合所述第一聚合物的所述配体是抗体，其中所述抗体连接在一起作为双特异性抗体。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述双特异性抗体是四聚体抗体复合物(TAC)。23.根据权利要求20所述的方法，其中所述TAC的浓度小于5μg/ml。24.根据权利要求23所述的方法，其中所述TAC的浓度小于1.5μg/ml。25.根据权利要求4所述的方法，其中与所述生物靶标结合的所述配体是抗体。26.根据权利要求4所述的方法，其中与所述第一聚合物结合的所述配体是抗体。27.根据权利要求1-2、10-11、15-16和18-26中任一项所述的方法，其中所述生物靶标选自细胞、细胞器、病毒、朊病毒、DNA、RNA、抗体、蛋白质、肽和小分子。28.根据权利要求1-2、10-11、15-16和18-26中任一项所述的方法，其中所述生物靶标是细胞。29.根据权利要求1-2、10-11、15-16和18-26中任一项所述的方法，其中所述第一聚合物具有的分子量高于0.5kDa。30.根据权利要求29所述的方法，其中所述第一聚合物具有的分子量高于5kDa。31.根据权利要求1-2、10-11、15-16和18-26中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物具有的分子量大于0.5kDa。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二聚合物具有的分子量大于5kDa。33.根据权利要求31所述的方法，其中所述第二聚合物具有的分子量大于8kDa。34.根据权利要求1-2、10-11、15-16和18-26中任一项所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于10分钟。35.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于5分钟。36.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于1分钟。37.根据权利要求34所述的方法，其中所述第二聚合物施用小于30秒。38.一种用于分离生物...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·J·克拉克，
申请(专利权)人：干细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：加拿大;CA