用于改善细胞鉴定的方法技术

本发明专利技术涉及显现包含至少一种特定细胞类型的细胞以及至少一种混杂细胞类型的细胞的微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法，其中所述至少一种特定细胞类型的细胞和所述至少一种混杂细胞类型的细胞二者都包含第二细胞标记，并且所述混杂细胞类型的细胞还包含所述至少一种特定细胞类型的细胞中不存在的第一细胞标记，所述方法包括下述步骤：将所述样品的细胞暴露于第一分子检测工具，其特异性结合所述第一细胞标记并且具有检测酶；通过由所述第一分子检测工具上的检测酶催化的反应在具有所述第二细胞标记的细胞内或周围产生封闭聚合物；将所述样品的细胞暴露于包含荧光染料的第二分子检测工具，所述第二分子检测工具特异性结合所述第二细胞标记；去除未与所述样品的细胞结合的第二分子检测工具；并且在所述方法的过程中，通过检测由所述第二分子检测工具的荧光染料得到的荧光信号并且通过检测在所述至少一种混杂细胞类型周围形成的封闭聚合物来显现所述至少一种特定细胞类型和所述至少一种混杂细胞类型。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于改善细胞鉴定的方法专利
本申请涉及免疫组织化学以及基于计算机的图像分析领域。具体地，本申请提供一种从组织学组织样品中提取信息并且利用该信息进行基于计算机的图像分析的方法。更具体地，本申请提供一种显现微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法。本申请还提供一种用于实施所述方法的部件的试剂盒。专利技术背景组织性组织样品的分析通常用于诊断目的，例如，分析乳腺组织样品来诊断乳腺癌，或用于研究目的，例如，研究炎性病症(如哮喘、动脉粥样硬化或炎性肠病)中的炎性细胞类型。免疫组织化学(IHC)，其中通过抗原特异性抗体检测标记分子(即，抗原，典型地为蛋白)，其常用于鉴定组织学切片中的细胞。对于一些细胞类型，可以通过检测单个细胞特异性抗原获得鉴定。然而，组织细胞的免疫组织化学鉴定领域的显著问题是许多细胞不能仅通过一种标记分子鉴定的事实。用于一种细胞类型的候选鉴定标记也可以存在于一些其他细胞类型上，并且妨碍了正确的鉴定。因此，找到鉴定并且排除混杂细胞类型的方法对于没有细胞特异性标记可用的细胞类型的可靠的鉴定是至关重要的。理想地，正确鉴定后，可能需要用显现活化标记的另外的IHC染色来研究所鉴定的细胞的激活状态或通过原位杂交技术来显现基因表达。任何患病的组织都典型地与改变的细胞群体的组成相关。例如，在哮喘的发炎的呼吸道中，存在构成呼吸道的结构细胞(如上皮细胞、腺细胞、血管细胞、神经等)的改变的组成。另外，一些类型的免疫细胞(即，白细胞)浸润发炎的呼吸道。事实上，在多种疾病中，组织的病理学(即，破坏性)改变不是仅被一种细胞类型引起的，而是几种细胞类型之间的复杂的相互作用。因此，当研究患病组织样品时，通常需要同时显现几种细胞群体和组织结构，或显现细胞群体与非细胞结构，如侵入的病毒或细胞外基质成分。关于组织中细胞内容物的信息可以通过当时染色连续切割的切片中的一种细胞类型而获得。尽管这种方法提供组织样品中的几种细胞类型的内容物的良好的估测，但是其没能提供关于所分析的细胞类型之间的空间关系(即，物理关系)的详细信息。由于细胞之间的大部分交叉感知需要紧密的物理接触，有时是直接的物理接触，所以这是主要的缺点。因此，可能需要显现同一张切片内的几种细胞群体。利用目前可用的IHC技术，使用复合色素原或复合免疫荧光技术可以染色一张切片中的至多3种细胞类型。然而，在常规的实践中，由于缺少一级检测抗体的适当的组合，通常仅可以同时检测2种细胞类型。为了增加可以在一张组织切片中显现的标记的数目，已经开发了新的方法学方法，如WO2010/115089中公开的SIMPLE技术，和MELC技术(Schubert等，NatureBiotechnology(自然生物技术)v.24，pp.1270-1278)。尽管有效力，但是这些新型技术主要开发用来共定位研究，并目每种都包括组织破坏性步骤、涉及破坏检测基团的步骤或依赖于检测分子标记的一级抗体。后一种限制排除了通过使用二级抗体对染色灵敏性的常规放大，使得这些方法对于检测常规组织学切片中的多种常规的细胞标记过于不灵敏。此外，由于上文提及的技术主要开发用于共定位研究，它们与其他常规免疫组织化学流程相似没能解决非目标细胞类型上偶然也可能存在多种鉴定标记的问题。正确检测没有针对其的单一特异性标记的细胞类型的一种方法是通过现有的IHC检测和检测色素原的包封来排除混杂细胞类型。在Andersson等，Thorax2009；vol.64，pp.297-305中，在线补充数据公开了一种方法，其中通过两步法分离了黏膜肥大细胞(MCT，对类胰蛋白酶是阳性的)和结缔组织肥大细胞(MCTC，对糜蛋白酶和类胰蛋白酶是阳性的)，其中第一IHC步骤通过棕色色素原DAB检测糜蛋白酶，而第二步骤通过红色色素原新品红检测余下的糜蛋白酶-阴性MCt细胞。尽管可用于检测组织切片中的MCt和MCTc群体，主要的缺点是由于其不透明的染色和由检测色素原引起的空间位阻，色素原包封的细胞都不能被进一步研究。因此，需要一种改善的且灵活的允许显现样品中的多种细胞标记的显现方法。具体地，需要非组织破坏性显现方法，所述方法使得其能够在最初的显现之后的后续步骤中进一步检测特定样品的感兴趣的细胞类型的细胞标记。专利技术概述依据本专利技术，通过提供显现包含至少一种特定细胞类型的细胞以及至少一种混杂细胞类型的细胞的微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法，上述问题得以解决，在所述方法中，所述至少一种特定细胞类型的细胞和所述至少一种混杂细胞类型的细胞二者都包含第二细胞标记，并且所述至少一种混杂细胞类型的细胞还包含所述至少一种特定细胞类型的细胞中不存在的第一细胞标记，所述方法包括下述步骤：将所述样品的细胞暴露于第一分子检测工具，所述第一分子检测工具特异性结合所述第一细胞标记并且具有检测酶；通过由所述第一分子检测工具上的所述检测酶催化的反应在具有所述第一细胞标记的混杂细胞内或周围产生封闭聚合物(blockingpolymer)；将所述样品的细胞暴露于包含荧光染料的第二分子检测工具，所述第二分子检测工具特异性结合所述第二细胞标记；去除未与所述样品的细胞结合的第二分子检测工具；并且在所述方法的过程中，通过检测由所述第二分子检测工具的荧光染料得到的荧光信号并且通过检测在所述至少一种混杂细胞类型周围形成的封闭聚合物来显现所述至少一种特定细胞类型和所述至少一种混杂细胞类型。专利技术详述本专利技术提供一种显现方法，鉴于目前的需要和技术限制，所述方法提供可能患病的组织中的细胞群体的显著改善的信息。因此，本专利技术提供一种新型方法学方法，其中感兴趣的细胞群体：1)得到正确的鉴定；2)随后被染色，例如，针对活化标记被染色；和3)在同一张组织切片中与其他细胞群体和非细胞结构一起显现。理想地，除了这些标准，任意此类技术应该能够分析完整的样品大切片并且提供关于所有标记的个体细胞的信息，如其在组织中的空间坐标、其尺寸和形状参数等。因此，在第一方面，并且在其最广泛意义上，本专利技术提供一种显现包含至少一种特定细胞类型的细胞以及至少一种混杂细胞类型的细胞的微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法，其中所述至少一种特定细胞类型的细胞和所述至少一种混杂细胞类型的细胞二者都包含第二细胞标记，并且所述混杂细胞类型的细胞还包含所述至少一种特定细胞类型的细胞中不存在的第一细胞标记，所述方法包括下述步骤：将所述样品的细胞暴露于第一分子检测工具，其特异性结合所述第一细胞标记并且具有检测酶；通过由所述第一分子检测工具上的检测酶催化的反应在具有所述第一细胞标记的混杂细胞内或周围产生封闭聚合物；将所述样品的细胞暴露于包含荧光染料的第二分子检测工具，所述第二分子检测工具特异性结合所述第二细胞标记；去除未与所述样品的细胞结合的第二分子检测工具；并且在所述方法的过程中，通过检测由所述第二分子检测工具的荧光染料得到的荧光信号并且通过检测在所述至少一种混杂细胞类型周围形成的封闭聚合物来显现所述至少一种特定细胞类型和所述至少一种混杂细胞类型。如本文公开的，术语“分子检测工具(means)”涉及双功能聚集物或缀合物，其包含能够特异性结合特定细胞标记的第一部分和能够产生可检测的响应的第二部分。多种不同类型的分子检测工具可以用于本专利技术，例如，适用于免疫组织化学、原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种显现包含至少一种特定细胞类型的细胞以及至少一种混杂细胞类型的细胞的微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法，其中所述至少一种特定细胞类型的细胞和所述至少一种混杂细胞类型的细胞二者都包含第二细胞标记，并且所述至少一种混杂细胞类型的细胞还包含所述至少一种特定细胞类型的细胞中不存在的第一细胞标记，所述方法包括下述步骤：将所述样品的细胞暴露于第一分子检测工具，所述第一分子检测工具特异性结合所述第一细胞标记并且具有检测酶；通过由所述第一分子检测工具上的所述检测酶催化的反应在具有所述第一细胞标记的混杂细胞内或周围产生封闭聚合物；将所述样品的细胞暴露于包含荧光染料的第二分子检测工具，所述第二分子检测工具特异性结合所述第二细胞标记；去除未与所述样品的细胞结合的第二分子检测工具；并且在所述方法的过程中，通过检测由所述第二分子检测工具的荧光染料得到的荧光信号并且通过检测在所述至少一种混杂细胞类型周围形成的封闭聚合物来显现所述至少一种特定细胞类型和所述至少一种混杂细胞类型。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.08.21 SE 1250936-01.一种显现包含至少一种特定细胞类型的细胞以及至少一种混杂细胞类型的细胞的微观多细胞组织样品中的多种细胞类型的方法，其中所述至少一种特定细胞类型的细胞和所述至少一种混杂细胞类型的细胞二者都包含第二细胞标记，并且所述至少一种混杂细胞类型的细胞还包含所述至少一种特定细胞类型的细胞中不存在的第一细胞标记，所述方法包括下述步骤：a)提供微观多细胞组织样品，已知所述样品包含至少一种混杂细胞类型的细胞以及至少一种特定细胞类型的细胞；b)将步骤a)所述的微观多细胞组织样品与至少一种抗体样配体的第一混合物一起温育，其中所述混合物的抗体样配体能够特异性结合混杂细胞上的细胞标记，但不结合所述至少一种特定细胞类型的细胞上的细胞标记，并且其中所述样品与所述第一混合物在有利于形成混杂细胞上的所述细胞标记与所述配体之间的特异性键合的条件下温育，导致形成所述细胞的所述细胞标记与所述配体之间的复合物；c)将步骤b)中形成的复合物与第一检测抗体样配体制剂一起温育，所述第一检测抗体样配体缀合在第一检测酶上，所述第一检测抗体样配体能够特异性结合所述第一混合物的抗体样配体，其中温育在有利于形成所述第一检测抗体样配体与所述第一混合物的抗体样配体之间的特异性键合的条件下进行，导致形成所述第一检测抗体样配体与步骤b)中形成的复合物之间的复合物；d)向步骤c)中形成的复合物中加入包含针对所述第一检测酶的底物的第一底物制剂，并且将得到的混合物在有利于形成可检测的聚合物的条件下温育，由此得到在所述微观多细胞组织样品的混杂细胞内或周围的可检测的积聚的聚合物；e)加入第一一级抗体样配体制剂，其中所述配体能够特异性结合在所述特定细胞类型上的细胞标记，并且将得到的混合物在有利于形成所述细胞标记与所述第一一级抗体样配体之间的复合物的条件下温育；f)向步骤e)中得到的混合物中加入第一二级抗体样配体制剂，所述第一二级抗体样配体缀合到荧光染料上，所述第一二级抗体样配体能够特异性结合所述第一一级抗体样配体，并且将得到的混合物在有利于形成所述第一一级与第一二级抗体样配体之间的特异性键合的条件下温育；g)通过洗涤步骤去除未结合的二级抗体样配体；h)化学固定所结合的一级和二级抗体样配体的复合物；i)将所得到的样品的细胞暴露于一组至少一种荧光染料-标记的抗体样配体制剂，所述至少一种荧光染料-标记的抗体样配体制剂的组中的每种制剂能够特异性结合与感兴趣的特定细胞类型相关联的独特的细胞标记，所述至少一种荧光染料-标记的抗体样配体制剂的组中的每种制剂具有能够发出独特的荧光信号的独特的荧光染料；j)通过洗涤步骤去除未结合的荧光染料-标记的配体；并且k)在所述方法的过程中，通过检测由一种或多种荧光染料获得的荧光信号并且通过检测已经在所述至少一种混杂细胞类型周围形成的封闭聚合物来显现所述至少一种特定的细胞类型和所述至少一种混杂细胞类型。2.根据权利要求1所述的显现方法，其中在步骤b)中，至少一种抗体样配体的第二混合物与所述第一混合物一起使用，其中所述第二混合物的抗体样配体能够特异性结合不同于所述第一混合物的配体所结合的混杂细胞类型的其他细胞标记，并且其中在步骤c)中使用第二检测抗体样配体制剂，所述第二检测抗体样配体能够特异性结合所述第二混合物的抗体样配体，所述第二检测抗体样配体具有第二检测酶，并且其中在步骤d)中加入包含针对所述第二检测酶的第二底物制剂，导致在与第二混合物结合的混杂细胞的周围形成另外的聚合物的积聚，并且其中在步骤k)中检测所述另外的聚合物的积聚。3.根据权利要求1所述的显现方法，其中在步骤c)之后和在步骤d)之前进行下述步骤：1)将步骤c)得到的混合物与抗体样配体的第二混合物一起温育，其中所述第二混合物的抗体样配体能够特异性结合不同于所述第一混合物所结合的其他混杂...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳斯·埃延弗特，
申请(专利权)人：医疗技术股份公司，
类型：发明
国别省市：瑞典;SE