利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路制造技术

本发明专利技术的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。本发明专利技术保护实现两种蛋白可调控式表达的方法：表达盒甲包括：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽连接的蛋白甲和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲(包括shRNA1的靶序列)；表达盒乙包括：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽连接的蛋白乙和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙(包括shRNA2的靶序列)；表达盒丙包括组成型启动子和激活元件的编码序列；将具有表达盒甲的重组载体甲、具有表达盒乙的重组载体乙和具有表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控蛋白甲和蛋白乙的表达。

【技术实现步骤摘要】
利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路
本专利技术涉及利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。
技术介绍
合成的基因线路经过精心设计，依据功能将基因调控装置组装起来，感受、整合、处理细胞内的分子信息，行使一定的功能。各种合成基因线路已发展在细胞内实现可定制、可编程的功能，包括动态行为、开关和记忆、细胞间通讯、适应性、细胞极化、数字和模拟计算和复杂的生物合成途径。这些基因线路中大多数是通过使用有限的基因元件和昂贵、低效的“尝试-错误”的方法构建。因此，为了简化设计和优化对活体细胞进行复杂的操作，研发出一个大规模的、功能定义良好的合成基因元件库和相应的计算模型和模拟方法是很有必要的。在针对哺乳动物的合成生物学研究领域，工程化的合成转录激活子和抑制子是支持可扩展的基因线路设计的一个重要的目标。目前，构建哺乳动物/真核生物转录抑制子常用的策略是融合一个转录抑制结构域和一个工程化的DNA结合蛋白结构域，比如锌指蛋白、转录激活子类似因子(TALE)蛋白和失活的Cas9(dCas9)核酸酶在RNA引导的CRISPR(簇状周期性间隔短回文重复序列)系统。然而，转录抑制结构域，如Krüppel相关盒(KRAB)转录抑制结构域和mSin相互作用结构域(SID4)通常会导致靶启动子附近的表观遗传学修饰，因而响应时间很慢。因此，这种转录抑制不适用于构建响应快速、可逆的基因线路。另一种普遍存在于原核生物中的转录抑制模式是通过无功能结构域的空间位阻，而这在真核生物中并不常见，例如，Lac抑制子(LacI)和四环素抑制子(TetR)通过低聚化结合在启动子附近的特异DNA序列，使DNA形成一个环，从而阻止转录起始核心元件在启动子区域的结合)。已有研究表明，在哺乳动物基因调控的环境下，在合成基因线路中把LacI结合位点放置在巨细胞病毒启动子(CMV)或者CAG启动子下游，可以抑制基因表达，虽然抑制效率在哺乳动物表达系统中低于原核表达系统。类似的，在哺乳动物系统中dCas9蛋白不融合任何转录抑制结构域也表现出弱的转录抑制功能。TALER蛋白由若干个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成。每个“蛋白模块”包含33-35个氨基酸残基，第12、13位氨基酸残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双连氨基酸残基(RVDs)位点。TALER蛋白上的每个RVD仅能识别一个碱基。TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALER蛋白(作为DNA结合域)与限制性内切酶FokⅠ(作为DNA切割域，又称抑制结构域)融合而得到的TALEN融合蛋白。TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂(DSB，Double-StrandBreaks)，从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制(NHEJ,Non-homologousEndJoining)修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误(缺失/插入)，从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供利用TALE转录抑制子在哺乳动物细胞中模块化构建合成基因线路。本专利技术保护的第一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-Ⅰ；所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括1个以上(具体可为4个)shRNA1的靶序列；所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括1个以上(具体可为4个)shRNA2的靶序列；所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。本专利技术保护的第二种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-Ⅰ；所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲‑Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙‑Ⅰ；所述表达盒甲‑Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲‑Ⅰ；所述靶序列甲‑Ⅰ包括1个以上shRNA1的靶序列；所述表达盒乙‑Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙‑Ⅰ；所述靶序列乙‑Ⅰ包括1个以上shRNA2的靶序列；所述表达盒甲‑Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙‑Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；所述表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲‑Ⅰ的重组载体甲‑Ⅰ、具有所述表达盒乙‑Ⅰ的重组载体乙‑Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。...

【技术特征摘要】
1.一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-Ⅰ；所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括1个以上shRNA1的靶序列；所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括1个以上shRNA2的靶序列；所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1或shRNA2调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。4.一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-Ⅰ；所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ和具有所述表达盒丙的重组载体丙导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……或shRNA2-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。7.一种实现两种蛋白可调控式表达的方法，包括如下步骤：将所述两种蛋白分别命名为蛋白甲和蛋白乙；蛋白甲的编码基因位于表达盒甲-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒乙-Ⅰ，蛋白乙的编码基因位于表达盒丁-Ⅰ；所述表达盒甲-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子甲、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白甲的编码基因和TALER蛋白甲的编码基因、靶序列甲-Ⅰ；所述靶序列甲-Ⅰ包括shRNA1-1的靶序列、……、shRNA1-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒乙-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子乙、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列乙-Ⅰ；所述靶序列乙-Ⅰ包括shRNA2-1的靶序列、……、shRNA2-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒丁-Ⅰ自上游至下游依次包括如下元件：反馈元件的编码序列、启动子丁、通过自剪切多肽的编码基因连接的蛋白乙的编码基因和TALER蛋白乙的编码基因、靶序列丁；所述靶序列丁-Ⅰ包括shRNA3-1的靶序列、……、shRNA3-n的靶序列，n为2以上的自然数；所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点，或，所述启动子甲的上游不具有所述TALER蛋白乙的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子乙的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游和下游各具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点，或，所述启动子丁的上游不具有所述TALER蛋白甲的靶点但其下游具有至少一个所述TALER蛋白甲的靶点；表达盒丙自上游至下游依次包括组成型启动子和激活元件的编码序列；在所述激活元件的刺激下，位于所述反馈元件的编码序列的下游的DNA表达；将具有所述表达盒甲-Ⅰ的重组载体甲-Ⅰ、具有所述表达盒乙-Ⅰ的重组载体乙-Ⅰ、具有所述表达盒丙的重组载体丙和具有所述表达盒丁-Ⅰ的重组载体丁-Ⅰ导入宿主细胞，通过加入shRNA1-1、……、shRNA1-n、shRNA2-1、……、shRNA2-n、shRNA3-1、……或shRNA3-n调控所述蛋白甲的表达和所述蛋白乙的表达。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲的上游具有1个所述TALER蛋白乙的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白乙的靶点；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点；所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁的上游具有1个所述TALER蛋白甲的靶点且其下游具有1-3个所述TALER蛋白甲的靶点。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述表达盒甲-Ⅰ中，所述启动子甲上游的TALER蛋白乙的靶点与所述启动子甲下游最邻近的TALER蛋白乙的靶点之间的距离为72-100bp；所述表达盒乙-Ⅰ中，所述启动子乙上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子乙下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp；所述表达盒丁-Ⅰ中，所述启动子丁上游的TALER蛋白甲的靶点与所述启动子丁下游最邻近的TALER蛋白甲的靶点之间的距离为72-100bp。10.一种从混合细胞中分选细胞甲和/或细胞乙的方法，包括如下步骤；所述细胞甲具有特定miRNA1；所述细胞乙具...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢震，威斯，李寅青，蒋云，廖微曦，陈赫，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：北京;11