用于使基因表达沉默的组合物和方法技术

提供一种将裸dsRNA引入种子中的方法。所述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于使基因表达沉默的组合物和方法专利
和背景本专利技术在其一些实施方案中涉及将dsRNA导入植物种子以调节基因表达的方法。随着世界人口不断增加，对食物、燃料和纤维的需求日益增长以及变化万千的气候，农业面临着前所未有的挑战。非常需要研发具有改良性状的植物，其中对农民和种子公司有重大利益的一些主要性状包括改进的非生物胁迫耐受性、肥料使用效率、抗病性、产量等等。植物性状改良通常通过遗传工程或经典育种进行。非常需要通过特定的基因改变用于性状改良的新的方法。这些包括用于基因过量表达或基因沉默的方法。序列特异性基因沉默的一项强大技术是通过RNA干扰(RNAi)。RNAi最早发现于线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)(Fire等1998，Nature，391:806-811)，是其中可通过将与个别基因同源的双链RNA(dsRNA)导入细胞而使所选基因的表达特异性沉默的一种机制。在细胞内，dsRNA分子被RNA酶III相关酶(Dicer)切割成21-27个核苷酸的较短片段。这些片段，称为小干扰RNA(siRNA)，被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。在另外的加工之后，siRNA转化成单链RNA，用作最终切割目标信使RNA的指导序列。通过使用RNAi使相关目标基因特异性沉默，可改变生物体的基本性状。特别对于植物，对可能导致高的胁迫抗性和更好的作物产量的修饰有着不可思议的潜力。在植物中，通常通过产生过量表达经转录产生dsRNA的DNA片段的转基因植物，来进行RNAi。这种dsRNA随后被加工成介导目标基因切割和沉默的siRNA。这种技术的主要技术限制是许多重要的植物作物种难以或不可能转化，阻碍了指导dsRNA产生的构建体的组成型表达。而且，有关抗病毒转基因植物的潜在生态影响的问题迄今为止严重限制了它们的应用[Tepfer,2002,Annu.Rev.Phytopathol.40,467-491]。获取转基因植物的另一个障碍归因于使转化和再生事件发生在同一细胞类型中的难度。因此开发用于获取不依赖于组织培养程序固有方法的转化种子的方法是植物分子生物学研究的前缘。其它
技术介绍
包括：美国20040055041教导了通过利用超声处理系统接着用土壤杆菌感染的种子转化。Chee等，1989PlantPhysiol.91:1212-1218教导了使用含有表达转基因的二元载体的土壤杆菌接种发芽大豆的胚芽、子叶节和邻近的子叶组织进行的大豆转化。其它的相关
技术介绍
：WO2011/001434、美国20080022423、WO2011112570、WO2007/080127、WO2007/080126、美国20060272049、美国2010068172、美国20070250947、WO9926467、美国20030154508、WO02/14472、美国20030150017、美国201000154083。专利技术概述按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供将裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA的分离种子，其中种子缺乏驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA的分离种子。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含以类似浓度存在于种子的胚和胚乳中的外源dsRNA的分离种子。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含空间上分布在植物种子的胚和胚乳中的外源dsRNA的分离种子，其空间分布不同于来源于重组表达外源dsRNA的转基因植物的种子的外源dsRNA的空间分布。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中与重组表达外源dsRNA的转基因种子相比，外源dsRNA与由其成熟的siRNA的浓度比率在所述种子中较高。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含外源dsRNA的分离种子，其中植物种子缺乏驱动外源dsRNA表达的异源启动子，其中与重组表达外源dsRNA的转基因种子的空间分布相比，外源dsRNA和/或由其成熟的siRNA的空间分布在所述种子中改变。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含外源裸dsRNA和缺乏驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子的植物或植物部分。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含大量种子的含种子装置。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供包含大量任何种子的播种田(sownfield)。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括在所述接触后将所述种子干燥。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括在所述产生后使所述植物在非生物胁迫或生物胁迫下生长。按照本专利技术的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供产生植物的方法，所述方法包括：(a)提供任何种子；和(b)使种子萌发以产生植物。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供调节基因表达的方法，所述方法包括：(a)在允许dsRNA渗透入种子的条件下使植物的种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中；和任选(b)产生种子的植物。按照本专利技术的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，设计裸dsRNA用于减量调节病毒病原体基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，渗透是进入种子的胚乳并且备选地或另外地进入种子的胚中。按照本专利技术的一些实施方案，裸dsRNA不整合到种子的基因组。按照本专利技术的一些实施方案，所述条件导致在萌发后dsRNA存在于植物中至少10天。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供抑制植物病毒的目标基因的表达的方法，所述方法包括向植物病毒提供植物或植物部分，从而抑制植物病毒的目标基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括在提供后观察病毒病原体可感染性或可复制性的降低。按照本专利技术一些实施方案的一个方面，提供将裸dsRNA引入种子中的试剂盒，其包括；(i)裸dsRNA；和(ii)引发溶液(primingsolution)。按照本专利技术的一些实施方案，裸dsRNA和引发溶液装在分开的容器中。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA包含siRNA。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA包含siRNA和dsRNA。按照本专利技术的一些实施方案，接触通过用dsRNA接种种子来实行。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法还包括在接触前引发种子。按照本专利技术的一些实施方案，所述引发如下实行：(i)在接触前洗涤种子；和(ii)在步骤(i)后将种子干燥。按照本专利技术的一些实施方案，在双重去离子水存在下实行洗涤。按照本专利技术的一些实施方案，实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包括在允许dsRNA渗透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子中。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.24 US 61/651131;2013.04.23 US 61/814890;201.一种将外源裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包括：
a.用水洗涤所述种子2-6小时；
b.在20-30℃的温度下干燥种子至多24小时；和
c.使种子与包含1μg/mL-261μg/mL的裸dsRNA和0.1mMEDTA的水溶液直接接触，其中裸dsRNA靶向内源植物基因或植物病毒病原体基因用于抑制，由此裸dsRNA渗透种子，从而将裸dsRNA引入种子中。


2.一种产生植物的方法，所述方法包括：
(a)按照权利要求1的方法将外源裸dsRNA引入种子中；和
(b)使种子萌发以产生植物。


3.一种调节自种子生长的植物中的基因表达的方法，所述方法包括：
(a)用水洗涤所述种子2-6小时；
(b)在20-30℃的温度下干燥种子至多24小时；
(c)使种子与包含1μg/mL-261μg/mL的裸dsRNA和0.1mMEDTA的水溶液直接接触，由此裸dsRNA渗透种子，从而将dsRNA引入种子中；和
(d)自种子产生植物，其中裸dsRNA靶向内源植物基因或病毒植物病原体基因用于抑制。


4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述内源植物基因与对非生物胁迫或生物威迫的耐受性有关。


5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述接触通过在水溶液中浸泡种子进行，并且其中所述方法还包括在所述浸泡后将所述种子干燥。


6.权利要求4的方法，所述方法还包括在所述产生后使所述植物在非生物胁迫或生物胁迫下生长。


7.权利要求1或3的方法，其中设计所述裸dsRNA用于减量调节植物基因的表达。


8.权利要求7的方法，其中所述植物基因是内源基因。


9.权利要求1或3的方法，其中设计所述裸dsRNA用于减量调节病毒病原...

【专利技术属性】
技术研发人员：A阿夫尼伊，E里多尔尼里，R茂尔，O梅尔，O奈维特布里克，O亚奈阿祖拉，
申请(专利权)人：AB种子有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL