本发明专利技术制备了HPV58-E6特异性兔单克隆抗体，包括如下步骤：设计HPV58E6特异性多肽段,合成多肽段并交联到两种载体。将合成好的多肽抗原免疫新西兰大白兔，测定血清滴度，Western Blot检测抗体特异性，然后将脾细胞与融合伴侣细胞进行细胞融合培养后，取上清检测抗体滴度及特异性,筛选出特异度及效价最好的融合细胞,将融合细胞裂解提取RNA，做RT-PCR，获得抗体重轻链cDNA, 构建入pTT5质粒载体，将包含重轻链质粒共转染到HEK-293-6E细胞进行表达获得重组抗体，即为HPV58-E6单克隆抗体。此抗体可用于Western Blot检测HPV58型癌基因E6的表达。
【技术实现步骤摘要】
HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用，属于医药领域。
技术介绍
目前，宫颈癌是发展中国家女性的主要死亡原因之一。人乳头瘤病毒HPV感染是导致宫颈癌的必要因素之一，依其致癌性分为高危型和低危型。人乳头状瘤病毒是高物种特异性的小的DNA肿瘤病毒，通过感染宫颈基底上皮进而引起宫颈病变。高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染已被认为是宫颈癌及其癌前病变的主要致病因素。已知的高危型别HPV有15种，HPV58属高危型HPV，较HPV16和HPV18少见，其感染例数占所有HPV感染总数的11.5％～28％，而在全世界范围内仅为0～3％。中国内地尤其是东南地区，是全球HPV58高发区之一，流行病学研究表明中国多个地区宫颈上皮内瘤变(CIN)和宫颈癌患者中HPV58阳性率甚至高于HPV18，仅次于HPV16。HPV58E6、E7是主要的原癌蛋白，具有使宿主细胞转化功能。E6和E7这两个病毒蛋白总在HPV阳性的宫颈癌细胞中表达。E6结合细胞内的泛素连接酶E6-AP(E6-associatedprotein)，使p53泛素化降解，不能转位入核，从而抑制p53发挥细胞阻滞与诱导凋亡的作用。E6蛋白还可以激活端粒酶的表达并调节含盘状同源区域(PDZ)结构域蛋白的活性及肿瘤坏死因子受体，使细胞达到永生化。E6与p53的相互作用可能影响酪氨酸激酶家族(Src)的非受体酪氨酸激酶的调节或使其降解，能激发HPV感染细胞的有丝分裂。HPV58属于HPVA9家族，其他还包括HPV16，31，33，35，52，67。其基因序列存在很大程度的相似性。目前市面上仅有HPV16-E6抗体，而没有HPV58-E6抗体。不同型别人乳头瘤病毒具有特异的基因序列，其致癌性也存在明显的差异。因此制备检测HPV58-E6的抗体对研究人乳头瘤病毒致宫颈癌机制具有重要的意义。将HPVA9家族的不同HPV型别的序列进行比对，比较HPV58与HPV16，31，33，52，67序列的相似度，找出差异序列，找到HPV58E6的特异性序列，针对该序列设计多肽，从而获得特异性HPV58E6多肽抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体及其制备方法与应用，所述HPV58E6抗体可用于检测HPV58E6蛋白。为实现上述目的，本专利技术采用以下方案进行实施：一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体，该抗体的基因序列由SEQIDNO.1所示的重链和SEQIDNO.2所示的轻链组成。一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)比较HPV58E6与HPV16E6，HPV31E6，HPV33E6，HPV52E6，HPV67E6序列，找出HPV58E6的特异性序列，针对该特异性序列设计多肽ZJM-1b；ZJM-1b的序列SEQIDNO.6所示；(2)用ZJM-1b免疫新西兰大白兔，取免疫后的新西兰大白兔的血清，用ELISA检测血清的抗体滴度，筛选出滴度大于ELISA血清滴度判断标准的血清样本；(3)将步骤2筛选出的血清样本进一步通过WesternBlot检测血清的抗体特异性，筛选出抗体阳性的大白兔；(4)将筛选出的大白兔的脾细胞与融合伴侣细胞240E-W2进行细胞融合，之后铺板到96孔培养板，在1640AB培养基(含有体积分数为9％的血清，体积分数为1％的GlutaMAX)中进行克隆培养，培养10天后换液，换液后继续培养5天，对上清进行ELISA筛选，找到阳性细胞克隆；(5)将阳性细胞克隆转移至24孔板继续培养6天(1640AB培养基，含有体积分数为9％的血清，体积分数为1％的GlutaMAX)，取细胞上清液，用ELISA测定上清液的滴度；将上清液20倍稀释后，用ELISA测定稀释液的滴度，筛选出上清液和稀释液滴度OD值均大于0.3的细胞上清液样本；(6)将步骤5筛选出的细胞上清液样本进行抗体WesternBlot检测，进一步筛选出表达HPV58E6特异性抗体的克隆；(7)针对每个克隆，提取RNA，用引物F1/R1进行RT-PCR扩增，得到多个重链cDNA和多个轻链cDNA；将cDNA分别构建到pTT5质粒表达载体中，将包含重链cDNA的pTT5质粒与包含轻链cDNA的pTT5质粒进行两两配对，共转染到HEK-293-6E细胞后进行细胞培养；引物F1/R1的基因序列分别如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示；(8)取细胞培养的上清液，进行ELISA检测；筛选IgG浓度最高且滴度OD值大于0.3的配对，即为HPV58E6特异性兔单克隆抗体的重链和轻链配对。一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体的应用，该应用为将HPV58E6特异性兔单克隆抗体应用于检测HPV58E6蛋白。本专利技术的有益效果是：本专利技术实验步骤简单易操作,周期短,易于获得所需抗体。本方法通过设计特异性多肽段，可以获得特异性强的抗体。通过设计重链轻链表达质粒，可以获得高效的重组抗体，明显缩短了时间。将HPV58E6特异性兔单克隆抗体可用于检测HPV58E6蛋白，检测特异性高，灵敏度高。附图说明图1是检测血清抗体westernblot图，图中，1和3上样样本为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提蛋白2和4上样样本为pEGFP-C1空载质粒转染293T细胞所提蛋白；1和2所用一抗为ZJM-1兔#YK-353以1：1000倍比稀释，3和4所用一抗为ZJM-1兔#YK-353以1：1000倍比稀释加5ug多肽阻断剂；图2是检测杂交瘤细胞上清westernblot图，图中，左边4条带为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染293T细胞所提蛋白，中间4条带为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染293T细胞所提蛋白，右边4条带为pEGFP-C1空载质粒转染293T细胞所提蛋白；所用一抗为：1所用一抗为ZJM-1-5以1:100稀释；2所用抗体为ZJM-1-9以1:100稀释；3所用抗体为ZJM-1-27以1:100稀释；4所用抗体为YK-353抗血清以1:1000稀释；图3是检测重组抗体westernblot图，图中，HPV58E6为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组，HPV16E6为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组；所用一抗为：IB-5为ZJM-1b-5以1:100稀释，IB-9为ZJM-1b-9以1:100稀释，IB-27为ZJM-1b-27以1:100稀释；图4是重组抗体SDS-PAGE纯度测定结果图；图5是检测HPV58E6表达westernblot图，图中，1为pEGFP-C1-HPV16E6质粒转染组，2为pEGFP-C1-HPV58E6质粒转染组，3为pEGFP-C1空载质粒组，4为空白对照组，5为marker。所用一抗为：使用HPV58E6特异性兔单克隆抗体。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例1：本实施例制备HPV58E6特异性兔单克隆抗体，包括以下步骤：第1步、多肽合成及交联从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/搜索出HPV58E6、HPV16E6、HPV31E本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体，其特征在于，该抗体的基因序列由SEQ ID NO.1所示的重链和SEQ ID NO.2所示的轻链组成。
【技术特征摘要】
1.一种HPV58E6特异性兔单克隆抗体，其特征在于，该抗体...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕卫国，邹健，程晓东，李阳，章鉴洋，谢幸，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属妇产科医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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