本发明专利技术公开了一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒。该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和复制蛋白变体标准品,其中试剂R1包含电解质、促凝剂、防腐剂及缓冲液;试剂R2包含抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、防腐剂及缓冲液;标准品为含有不同浓度复制蛋白变体的适当缓冲液。本试剂盒特异性强,灵敏度高,准确度好,操作快速简便,可用于各种生化分析仪。
【技术实现步骤摘要】
一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒
本专利技术属于医学免疫体外诊断试剂领域,涉及一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒。
技术介绍
人复制蛋白CIZ1(Cip1interactingzincfingerprotein1)是参与DNA复制的一种核蛋白,它与包括多种癌症在内的很多人类疾病相关。有研究表明,第14、15号外显子发生突变的CIZ1突变体(CIZ1-V)是一个早期肺癌和多种肿瘤生物标记物,以它作为肿瘤特异性检测单标记物,能够不依靠传统医学的侵入性检测手段从风险人群中诊断鉴定出患有早期肺癌的患者。由于目前CIZ1突变体(CIZ1-V)的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR很短,一般的检测需要基因测序或侵入性检测手段才能通过PCR等技术进行检测。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的上述缺陷,提供一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现:一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和复制蛋白变体标准品溶液,其中:所述试剂R1包含电解质、促凝剂、防腐剂及缓冲液;所述试剂R2包含抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、防腐剂及缓冲液;所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的缓冲液。优选的,所述的反应缓冲液为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液或DIPSO缓冲液中的一种或几种,缓冲液浓度在20-200mM之间。优选的,所述R1中防腐剂优选叠氮钠(NaN3),促凝剂选自PEG6000、PEG8000和PEG12000,优选PEG6000或不同PEG的混合体,在试剂R2中的浓度为2.0%-3.5%。优选的,所述的胶乳颗粒为直径范围0.05-0.20μm的聚苯乙烯胶乳颗粒,试剂R2中胶乳颗粒浓度为0.1%-0.8%。进一步优选的,所述的胶乳颗粒为直径0.13μm的聚苯乙烯胶乳颗粒,试剂R2中胶乳颗粒浓度为0.2%。所述的抗人复制蛋白变体的多克隆抗体选自兔、羊、鸡的免疫球蛋白,优选兔抗,经人复制蛋白变体免疫、亲和层析纯化获得的免疫球蛋白;进一步优选合成CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR(SEQIDNO.1),将合成的多肽序列偶联至血蓝蛋白载体蛋白上制备抗原并免疫兔、羊、鸡、再经亲和层析纯化获得的免疫球蛋白。抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被胶乳颗粒是通过化学交联剂在交联缓冲液中进行的,所用化学交联剂为碳化二亚胺(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS),交联缓冲液选自PBS缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、甘氨酸缓冲液、醋酸缓冲液或DIPSO缓冲液,pH在6.0-8.0之间。优选的,所述抗人复制蛋白变体的多克隆抗体利用化学交联剂碳化二亚胺(EDAC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)定向固定在苯乙烯胶乳颗粒上的途径为:取20μg胶乳微球于1.5mLEP管中,加入1mLMES缓冲液(pH6.0),枪头混匀;14000rpm离心30min,去上清,加入0.5mLEDAC溶液(0.2-2.0mg/mL),22℃16rpm旋转10min;再加入50μLNHS溶液(0.2-2.0mg/mL),22℃16rpm旋转30min,胶乳颗粒得到活化,之后14000rpm离心30min,去上清,加入1mL50mMPBS缓冲液(pH7.4),枪头混匀;14000rpm离心30min,去上清,加入1mL50mMPBS缓冲液(pH7.4),超声15s,加入20μgCIZ1-V抗体,37℃16rpm旋转2h;加入10μL终止液(1M甘氨酸+10%BSA),37℃16rpm旋转1h。14000rpm离心25min,去上清,加入1mL贮存液(30mMpH7.4的Hepes或DIPSO缓冲液,防腐剂0.1%NaN3,电解质0.01%NaCl,稳定剂0.01%EDTANa2和0.09%BSA),超声20s;14000rpm离心20min,去上清,加入1mL贮存液,超声20s,4℃保存。所述的复制蛋白变体标准品通过以下方法制备:合成CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR,将合成的多肽偶联至卵白蛋白(OVA)载体蛋白得到复制蛋白变体标准品。优选的,所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的适当缓冲液,其中复制蛋白变体含量分别为0μg/mL、0.50μg/mL、1.00μg/mL、2.00μg/mL、4.00μg/mL、8.00μg/mL或类似比例浓度,缓冲液为PBS缓冲液、Hepes缓冲液或Tris-HCl缓冲液中的一种或几种。优选的,检测时R1、R2分别加取112.5μL和37.5μL,样品加样量为2-8μL,或类似比例整体增减。最优选的,检测人血清中复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒组成如下:试剂R1:50mMPBS缓冲液(pH7.4),2.5%PEG8000,0.015%NaCl,0.5%NaN3;试剂R2:0.2%兔抗人复制蛋白变体抗体包被胶乳颗粒(粒径0.13μm),30mMpH7.4的Hepes或DIPSO缓冲液,0.1%NaN3,0.01%NaCl,0.01%EDTANa2和0.09%BSA;复制蛋白变体标准品溶液:合成的CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR偶联卵白蛋白(OVA)载体蛋白作为抗原标准品,50mMPBS缓冲液(pH7.4)。在本专利技术中,复制蛋白变体与胶乳颗粒包被的兔抗人复制蛋白变体多克隆抗体发生抗原抗体反应,形成抗原—抗体—胶乳颗粒复合物,导致浊度上升,优选的,测定此浊度在500-600nm(最优选的,600nm)波长处的吸光度,对照标准曲线即可计算样本中复制蛋白变体含量。有益效果:目前关于CIZ1-V的报道还非常少,也没有相关试剂盒技术及产品面世。由于目前CIZ1突变体(CIZ1-V)的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR很短,一般的检测需要基因测序或侵入性检测手段才能通过PCR等技术进行检测。本专利技术将CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR偶联至血蓝蛋白载体蛋白上制备抗原,并免疫兔、羊、鸡、再经亲和层析纯化获得的免疫球蛋白。合成CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽序列CDEDEEEIEVRSRDISR,将合成的多肽偶联至卵白蛋白(OVA)载体蛋白得到复制蛋白变体标准品,使得突变小片段也能用常规的胶乳增强免疫比浊试剂盒通过优化条件,能够在全自动生化检测仪上进行检测,达到成本低、方便、快速、正确进行临床检测。本专利技术用化学偶联法将特异性兔抗人复制蛋白变体抗体包被到活化后得胶乳颗粒表面,并通过添加特定的稳定剂、防腐剂和促凝剂使胶乳颗粒形成均一稳定的悬浊液。使用时操作简便快捷,适应临床快速高通量筛查的要求。特异性抗体免疫球蛋白的使用保证了试剂盒较高的特异性,有效避免了其它物质的干扰。本专利技术的性能鉴定选择了灵敏性、准确性、本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒,其特征在于该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和复制蛋白变体标准品溶液,其中:所述试剂R1包含电解质、促凝剂、防腐剂及缓冲液;所述试剂R2包含抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、防腐剂及缓冲液;所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的缓冲液。
【技术特征摘要】
1.一种检测人复制蛋白变体含量的胶乳增强免疫比浊试剂盒,其特征在于该试剂盒包括试剂R1、试剂R2和复制蛋白变体标准品溶液,其中:所述试剂R1包含电解质、促凝剂、防腐剂及缓冲液;所述试剂R2包含抗人复制蛋白变体的多克隆抗体包被的胶乳颗粒、电解质、稳定剂、防腐剂及缓冲液;所述的抗人复制蛋白变体的多克隆抗体为通过合成如SEQIDNO.1所示的CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽,将合成的多肽偶联至血蓝蛋白载体蛋白上制备抗原并免疫兔、羊、鸡、再经亲和层析纯化获得的免疫球蛋白;所述复制蛋白变体标准品溶液为含有不同浓度复制蛋白变体标准品的缓冲液;所述的复制蛋白变体标准品通过以下方法制备:合成如SEQIDNO.1所示的CIZ1-V第14、15号外显子基因表达的突变片段多肽,将合成的多肽偶联至卵白蛋白(OVA)载体蛋白得到复制蛋白变体标准品;所述的胶乳颗粒为直径范围0.05-0.20μm的聚苯乙烯胶乳颗粒,试剂R2中胶乳颗粒浓度为0.1%-0.8%;试剂R1中所述促凝剂选自浓度为2.5%的PEG6000或不同PEG的混合体;试...
【专利技术属性】
技术研发人员:徐根兴,曹娅,华子春,李明,
申请(专利权)人:南京吉瑞康生物科技有限公司,南京大学,
类型:发明
国别省市:江苏;32
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