本发明专利技术公开了一种鱼类NKEF‑A重组蛋白对适应性体液免疫的活化效应及其应用，所述的应用为用于制备能够促进鱼类体液免疫能力的免疫增强剂，所述鱼类NKEF‑A重组蛋白的氨基酸序列为SEQID NO:1所示；本发明专利技术提供的NKEF‑A重组蛋白作为适应性体液免疫增强剂，其优点在于：(1)使用剂量小，效率高；以1:100(NKEF‑A蛋白:抗原)的NKEF‑A重组蛋白剂量即可发挥显著的免疫促进作用；(2)易于制备免疫混合液：NKEF‑A重组蛋白是可溶性蛋白，容易与抗原混合，克服了传统矿物油乳剂类制剂不易乳化抗原的缺点；(3)安全性高；与细菌毒素或化合物制剂不同，NKEF‑A是宿主自身的蛋白，不存在外源物质导入产生的潜在毒副作用。
【技术实现步骤摘要】
鱼类NKEF-A重组蛋白对适应性体液免疫的活化效应及其应用(一)
本专利技术涉及水产生物技术和水产养殖病害防治领域，特别涉及一种天然杀伤细胞增强因子A(NaturalKillerEnhancerFactorA,NKEF-A)促进鱼类适应性体液免疫的新功能及其应用。(二)
技术介绍
随着渔业生产迅猛发展，养殖水产动物病害日益突出，严重制约了水产业健康可持续发展。长期来由于缺乏有效的病害防治方法，各种抗生素、杀虫剂广泛使用，造成养殖环境和水产品污染，水产食品安全受到威胁，同时抗生素产生的耐药性又加剧了水产动物病害发生。因此，研制开发天然、安全和高效的水产动物病害防治制剂及其应用技术是一项十分紧迫的任务。鱼类免疫抗病基因的开发利用是从根本上解决水产动物病害防治，保障水产食品安全的有效途径，代表了当前发展绿色和环境友好型水产养殖模式的主要方向。但长期来国内外对水产动物免疫抗病基因的研究相对薄弱，因此所开发的免疫抗病基因数量尚十分有限。天然杀伤细胞增强因子(NKEF)最初在人红细胞中被发现，因其能增强天然杀伤细胞(NaturalKiller,NK)的细胞毒效应而得以命名。近年来研究表明，NKEF除了具有增强NK细胞活性外，还具有抗氧化等功能。但对其是否具有其他的生物学功能，如是否对适应性免疫具有调节功能尚不清楚。本专利技术首次揭示NKEF-A具有促进鱼类适应性体液免疫的新功能，发现其可以显著提高鱼类适应性体液免疫，实现对鱼类病害的有效防治。功能机制研究表明，NKEF-A能通过抗原递呈细胞(APC)表面的TLR4受体激活NF-κB炎症信号通路，上调共刺激信号分子CD40、CD80/86和CD83等的表达，促进CD4+T细胞增殖活化以及IgM抗体的产生，从而发挥增强适应性体液免疫功能。本专利技术不仅丰富了鱼类免疫学知识，而且为鱼类病害的免疫防治开辟了新途径，具有广阔的应用前景。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种鱼类NKEF-A重组蛋白的新应用，具体为鱼类NKEF-A重组蛋白促进鱼类体液免疫能力的应用，将NKEF-A重组蛋白与嗜水气单胞菌全细胞疫苗配合使用，从而提高预防鱼类细菌性出血性败血症的效果。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种鱼类NKEF-A重组蛋白在制备增强鱼类体液免疫能力的免疫增强剂中的应用，所述鱼类NKEF-A重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示(核苷酸序列为SEQIDNO:2所示)，其用途是促进疫苗制剂的适应性体液免疫应答，包括但并不限于蛋白抗原疫苗、细菌全菌灭活疫苗等诱导的适应性体液免疫应答。所述的增强鱼类体液免疫的免疫增强剂为治疗鱼类败血症的制剂，所述制剂由嗜水气单胞菌全细胞疫苗和具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重组蛋白构成；所述制剂的给药途径采用皮下注射的方式，所述具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的重组蛋白用量为0.1～0.25μg/尾，所述嗜水气单胞菌全细胞疫苗用量为5×105～5×106CFU/尾，在35天内产生效力。NKEF-A重组蛋白促进鱼类适应性体液免疫的功能机制是，该因子能促进抗原递呈细胞(APC)表达CD40、CD80/86和CD83等共刺激信号分子，增强CD4+T细胞增殖活化以及IgM抗体的产生。本专利技术利用大肠杆菌原核表达系统(pET28a和RosettaBL21)体外表达获得河豚NKEF-A重组蛋白，将此重组蛋白分别与外源抗原蛋白和细菌全菌灭活疫苗共同免疫实验动物斑马鱼。利用荧光定量PCR(qPCR)和流式细胞术等技术，检测抗原递呈细胞(APC)以及T、B淋巴细胞活性，利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测B细胞产生抗体(IgM)的变化。发现NKEF-A重组蛋白能显著促进APC以及T、B淋巴细胞活性标志分子的转录水平，促进T、B淋巴细胞增殖以及B细胞产生抗体(IgM)的滴度。证明NKEF-A重组蛋白可以通过促进免疫细胞的活化和抗体产生等途径，激活机体的适应性体液免疫，增强机体免疫力，提高对细菌感染的抵御功能，增加机体存活率。目前在人类和哺乳动物中使用的适应性免疫增强剂有白细胞介素、干扰素等细胞因子，铝盐、皂苷、鲨烯、脂质体、矿物油等化合物，百日咳杆菌、胞壁酰二肽、单磷酸脂质A、细菌毒素(如霍乱弧菌肠毒素和大肠杆菌肠毒素)等细菌结构组分或代谢分泌产物等。理想的免疫增强剂应该是无毒副作用，对免疫系统具有显著的激活作用，便于生产和使用。事实上，上述制剂还没有任何一种类型能完全满足这些要求，由于大多数制剂来源于细菌产物或化合物，因此使用中存在不同程度的安全性问题。与现有技术相比，本专利技术提供的NKEF-A重组蛋白作为适应性体液免疫增强剂，其优点在于：(1)使用剂量小，效率高；以质量比1:100(NKEF-A蛋白：抗原)的NKEF-A重组蛋白剂量即可发挥显著的免疫促进作用，而传统矿物油乳剂类制剂与抗原的质量比例为1:1；(2)易于制备免疫混合液；NKEF-A重组蛋白是可溶性蛋白，容易与抗原混合，克服了传统矿物油乳剂类制剂不易乳化抗原的缺点；(3)安全性高；与细菌毒素或化合物制剂不同，NKEF-A是宿主自身的蛋白，不存在外源物质导入产生的潜在毒副作用。(四)附图说明图1为NKEF-A重组蛋白的cDNA分子克隆的PCR检测结果。M：DNAMarker，第1～6泳道为实施例1中PCR扩增产物，均得到预期的扩增条带。图2为NKEF-A重组蛋白的SDS-PAGE分析结果；M：标准蛋白分子量Marker，泳道1为未诱导对照，泳道2为NKEF-A重组蛋白诱导表达结果，预期大小22.3KDa。图3为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化APC的结果。上：实时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后MHC-II和CD80/86的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后APC的活化结果。图4为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化T淋巴细胞的结果。上：实时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后Lck和CD154的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后T细胞的活化结果。图5为NKEF-A重组蛋白促进KLH抗原活化B淋巴细胞的结果。上：实时荧光定量分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后CD40和mIgM的改变结果。下：流式细胞术分析PBS、KLH、KLH+NKEF-A分别刺激后B细胞的活化结果。图6为NKEF-A重组蛋白促进抗体(IgM)产生的结果。图7为NKEF-A重组蛋白对细菌疫苗免疫保护的存活率变化曲线图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例1、编码NKEF-A蛋白的cDNA分子克隆依照Trizol试剂盒(TaKaRa)的说明从河豚脾脏提取RNA，采用3'-FullRACECoreSet试剂盒(TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA，以此cDNA为模板，使用正向引物F1：5’-CCATGGCTGCAGGCAAAGCTC-3’和反向引物R1：5’-CTCGAGGTGCTTGGAGAAGAACTC-3’进行PCR(体系见表1)扩增，获得NKEF-A重组蛋白的编码核苷酸序列。PCR条件为：94℃预变性4min本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鱼类NKEF‑A重组蛋白在制备增强鱼类体液免疫的增强剂中的应用，其特征在于所述鱼类NKEF‑A重组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。
【技术特征摘要】
1.一种鱼类NKEF-A重组蛋白在制备治疗鱼类败血症制剂中的应用，其特征在于所述鱼类NKEF-A重组蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述制剂由嗜水气单胞菌全细胞疫苗和具有SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵建忠，刘广平，项黎新，董伟仁，聂力，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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