一种检测天然多克隆抗癌抗体的组合物、试剂盒和方法技术

本发明专利技术涉及一种用于检测天然多克隆抗癌抗体(NPAA)的组合物、由该组合物制成的试剂盒、使用该组合物或该试剂盒检测血浆中NPAA浓度的方法、以及该组合物或该试剂盒在检测血浆NPAA中的应用。本发明专利技术利用与目标NPAA完全互补的4种线性抗原多肽实现对血浆中NPAA的定性、定量检测，可用于区分富含NPAA和不含NPAA的血浆。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学
，涉及四种肽类抗原，可应用于制备酶联免疫吸附法(ELISA)抗体检测试剂盒，用以检测血浆中天然多克隆抗癌抗体(NPAA)浓度。
技术介绍
恶性肿瘤是威胁整个人类健康的最主要杀手之一。基于灰霾雾霾等环境污染状况的持续存在，中国人群主要癌症的发病率呈逐年上升趋势。据统计，目前我国癌症平均每年发病率高达3/1000以上。虽然肿瘤早期治疗手段，如手术切除或放射线治疗已发展的比较成熟，能够明显延长病人的存活时间，但大约60％的癌症患者在接受局部治疗后仍有可能在一年内复发，大约90％的病人最终死于肿瘤的复发和转移。因此，如何在肿瘤治疗领域探索一种创新的控制肿瘤复发和转移的免疫支持手段，是本专利技术技术的主要目的之一。近年来的研究表明，检测肿瘤相关抗原或抗体具有指导靶向治疗价值。例如，临床上已广泛应用的曲妥株单抗(Trastuzumab)和贝伐株单抗(Bevacizumab)就是以人上皮细胞生长因子二型受体(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)和血管内皮细胞生长因子A(Vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)为标靶，成为临床治疗中晚期肿瘤的重要手段。然而，由于副作用太大，这两种单克隆抗体只能做为三线治疗药物。因此，发展可用于防止肿瘤局部治疗后转移和复发、且副作用低的新型手段是目前亟待解决的问题。从免疫治疗领域解决这个难题的关键在于设计具有创新性的标靶技术实施方案，然后发展能有效防治肿瘤的新型技术。血管内皮细胞生长因子一型受体(Vascular endothelial growth factor receptor 1,VEGFR1)是一种跨膜蛋白，也是一种公认的癌细胞表达的特异性蛋白。大量的研究工作发现，许多人类实体肿瘤可大量表达VEGFR1，如肝癌，肺癌，肾癌，肠癌及乳腺癌等。因为VEGFR1抗原表位多肽主要位于肿瘤细胞表面，可成为相应抗体直接攻击杀伤肿瘤的靶点(如贝伐株单抗治疗原理)，也可间接地影响其功能而限制肿瘤的生长与发展。HER2是受体型酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases)家族成员之一，也是一种跨膜醣蛋白。目前发现，多种实体肿瘤可表达HER2，包括乳腺癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌及头颈部癌肿等。在现有技术中，曲妥株单抗对治疗HER2表达阳性的乳腺癌具有显著的疗效。上皮粘蛋白1(Mucin 1,MUC1)是一种醣化的细胞膜蛋白，多数常见上皮恶性肿瘤细胞均大量表达MUC1，且与恶性细胞的快速增生有关。故MUC1是非常重要的肿瘤标靶，在发展癌症免疫疗法中具有重大意义。基于MUC1蛋白为靶标的肿瘤疫苗技术目前已在国外进入临床试验阶段。可以预见，全新的化疗手段未来在肿瘤治疗中的地位将越来越重要。越来越多的临床研究表明，许多恶性肿瘤可能存在原发耐药性(intrinsic resistance)，即对初始化疗药物不敏感，因而导致化疗失败。原发耐药性形成的主要机理之一，是因为肿瘤细胞表达耐药蛋白，例如ATP结合盒(ABC)转运蛋白。这种转运蛋白发挥泵功能，可以将进入肿瘤细胞内的化疗药物转移到细胞外，进而保护细胞免受药物的杀伤。基因表达谱筛查及大量临床病理研究证实，多种肿瘤细胞表达ABCC3转运蛋白，其中包括乳腺癌、食道癌、肺癌、肾癌及头颈部癌肿等。据此，ABCC3转运蛋白可以成为针对具有原发耐药性肿瘤的免疫治疗标靶。众所周知，由于细胞在增殖和发育过程中可能发生突变，健康人的体内每天都会出现一定数量的癌细胞。但是，由于免疫监视功能的存在，这些癌细胞可被人体中的各种抗体和免疫细胞及时清除。本专利技术正是基于免疫监视功能的原理，建立筛查存在正常人体内的天然抗癌抗体技术，为进一步发展癌症防治方法和预测肿瘤发病风险奠定基础。
技术实现思路
本专利技术人发现，健康人体内会自然形成与前述HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白的抗原表位序列相对应的特异性抗体，并单独或与免疫细胞协同作用抑杀癌细胞。本专利技术中将这类人体内自然形成的、能识别其中一种或多种癌细胞特异性蛋白的抗原表位的抗癌抗体统称为“天然多克隆抗癌抗体”(natural polyclonal anti-cancer antibody,NPAA)。人血浆中NPAA可以认为是一类天然抗肿瘤抗体，在人体内执行免疫监视和免疫清除功能，防止肿瘤的形成与发展。因此，本专利技术的主要目的是提供一组用于检测健康人血浆中NPAA浓度的线性抗原多肽和由此制备的试剂盒，以及使用该组抗原多肽或该试剂盒检测人血浆中NPAA的方法。所述抗原多肽为HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白的抗原表位。这些抗原表位能够与人血浆中针对HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3的特异性抗体结合。如本专利技术所定义的“天然多克隆抗癌抗体(NPAA)”是天然存在于健康人体内的，能识别一种或多种癌细胞特异性蛋白抗原表位的抗体或多克隆抗体混合物，或者说优选能识别HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种癌细胞特异性蛋白抗原表位的一种或多种抗体或多克隆抗体混合物。在本专利技术的特定实施方案中，所述NPAA是指能识别SEQ ID NO:1-4中的一个或多个表位序列的抗体或多克隆抗体混合物。本专利技术人利用免疫信息学方法和计算机软件，在HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3蛋白序列上进行人类白细胞二类抗原(Human leukocyte antigen II,HLA-II)表位制图，甄别具有高度亲和力的序列，进而设计能被绝大多数人类抗原提呈细胞识别的HLA-II限制性表位及线性抗原多肽。已经公认，抗原抗体的结合主要发生在抗原决定簇与抗体结合位点之间。因此，两者在空间结构和构型上越接近完全互补，抗原抗体的结合就越稳定，特异性就越强，结合效率就越高，因此，目标抗体(待检测抗体)及其结合位点结构是先决因素，抗原决定簇影响整个蛋白抗原与抗体结合状态和亲和特性。本专利技术根据HER2、VEGFR1、MUC1和ABCC3四种蛋白的生物学特性，针对这四种蛋白的多个表位进行免疫信息学预测和模拟，经分析与抗原性相关的各种参数，分别设计了四种在空间结构和构型上与目标抗体完全互补的线性抗原多肽，其氨基酸序列见表1。表1.检测人血浆中NPAA的线性抗原多肽序列经固相化学法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测NPAA抗体的组合物，其包括如下4种抗原多肽:H‑LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP‑OH；H‑GEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI‑OH；H‑VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD‑OH；H‑LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL‑OH。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测NPAA抗体的组合物，其包括如下4种抗原多肽:
H-LCRWGLLLALLPPGAASTQVCTGTDMKLRLPASP-OH；
H-GEDLKLSCTVNKFLYRDVTWILLRTVNNRTMHYSI-OH；
H-VQLTLAFREGTINVDVETQFNQYKTEAASRYNLTISD-OH；
H-LLYVGQSAAAIGANVWLSAWTNDAMADSRQNNTSL-OH。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于：所述组合物中各抗
原多肽的比例为1:1:1:1(浓度比或体积比)。
3.由权利要求1或2的组合物制成的试剂盒。
4.根据权利要求3的试剂盒，将4种抗原多肽混合液包被的马来酰
亚胺(Maleimide)活化96孔微量检测板干燥后，用非金属医用包装材料
真空密封包装，制成试剂盒。
5.根据权利要求4的试剂盒，其中所述材料为玻璃或医用塑料。
6.一种体外的、非诊断目的检测个体血...

【专利技术属性】
技术研发人员：尉军，孟庆勇，
申请(专利权)人：深圳市海兰深生物医学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44