利用发酵和催化相结合的方法制备己二酸和己二酸盐的替代合成路径技术

本申请公开了利用生物学途径和化学催化制备己二酸盐或己二酸的方法。高柠檬酸可作为在己二酸或其盐制备反应途径中的反应底物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】序列表本申请包含序列表，已通过EFS-Web提交了ASCII格式文本，并通过整体引用的方式包含于本申请中。所述ASCII副本，创制于2013年9月10日，名称为DNP-10-1205WO_SL.txt，文件大小为9164字节。
本申请涉及制备己二酸盐和己二酸的方法。
技术介绍
目前，许多含碳的化学物质都源自于石油资源。依赖于石油资源的化学原料导致石油资源的枯竭以及与石油钻探相关的不良环境影响。通过糖发酵获得的某些碳质产品有望替代源于石油的化学原料，用于制造含碳的化学物质。上述碳质产品包括己二酸和己二酸盐。在目前石油源化学原料主导的工业生产领域中，己二酸具有很大的市场空间，如3-酮己二酸盐、3-羟基己二酸盐和己烯二酸盐的己二酸盐也可用作生产许多功能性二酸的前体物质。
技术实现思路
我们提供了一种制备己二酸或己二酸盐的方法，包括以下步骤：a)缩合α-酮戊二酸盐与乙酰辅酶A制得高柠檬酸盐；b)通过至少一个化学反应使高柠檬酸盐转化为己二酸盐或己二酸；以及c)可选地，分离己二酸盐或己二酸。我们还提供了一种制备己二酸或己二酸盐的方法，包括以下步骤：a)准备高柠檬酸盐；b)高柠檬酸盐脱羧基制得3-酮己二酸盐；以及c)直接或通过选自3-羟基己二酸盐和己烯二酸盐中的至少一种中间产物转化3-酮己二酸盐制得己二酸或己二酸盐。我们还提供了一种制备己二酸酯的方法，包括以下步骤：a)准备高柠檬酸盐；b)高柠檬酸盐脱羧基制得3-酮己二酸盐；c)3-酮己二酸盐转化为3-酮己二酸酯；d)直接或通过选自3-羟基己二酸酯和己烯二酸酯中的至少一种中间产物转化3-酮己二酸酯制得己二酸酯；以及e)可选地，将己二酸酯转化为己二酸。我们进一步提供了一种制备己二酸盐或其酸的方法，包括以下步骤：a)准备高柠檬酸盐；b)处理高柠檬酸盐制得高柠檬酸内酯；c)高柠檬酸内酯脱氢制得4-羧基-粘康酸内酯；d)4-羧基-粘康酸内酯脱羧基制得5-甲酯基-丁内酯-4-烯(5-carbomethoxy-GBL-4-ene)；e)5-甲酯基-丁内酯-4-烯互变异构制得3-酮己二酸盐；以及f)可选地，将3-酮己二酸盐转化为己二酸盐或己二酸。附图说明图1示意性说明由高柠檬酸盐制备己二酸盐和己二酸的合成路径。图2示意性说明将高柠檬酸盐经高柠檬酸内酯转化为己二酸或己二酸盐。图3为质粒pBA006的示意图，该质粒包含大肠杆菌密码子优化的高柠檬酸合酶(nifV)和高异柠檬酸脱氢酶(aksF_Mm)基因。图4为质粒pBA066的示意图，该质粒包含大肠杆菌密码子优化的高柠檬酸合酶(nifV)和高异柠檬酸脱氢酶(aksF_C5)基因。图5为与对照细胞(BL21)相对比，高柠檬酸合酶在BA066原溶解产物中的活性结果。图6为与对照细胞(BL21)相对比，经质粒pBA066转导的BA066细胞溶解产物中不溶部分和可溶部分的SDS-PAGE电泳结果。具体实施方式与多步骤的生化途径相比，结合生物学和热化学方法制备化工原料是一种更为快捷和经济的途径。该途径经常能够获得具有商业价值的中间产物。上述方法可应用于制备己二酸、己二酸盐和己二酸酯。例如，我们提供了一些利用高柠檬酸盐和3-酮己二酸盐作为初始化合物和/或化学中间体的化学途径和生化途径。公开的生化途径可包括一种或多种蛋白质或酶的活性，尤其是异源性酶，该蛋白质或酶可催化反应使反应底物转化为产品或中间产物。利用本领域现有的技术可修饰微生物使其表达一种或多种蛋白质或酶。相应的，我们提供了工程代谢途径、分离核酸或工程核酸、多肽或工程多肽、宿主细胞或基因工程宿主细胞、由碳源制得目标化合物或中间产物的方法以及原料。适合作为本专利技术生物合成途径起始点的碳源包括碳水化合物和合成中间体。例如细胞能够代谢的碳水化合物包括糖类，如葡萄糖、葡聚糖、甘油三酯和脂肪酸。代谢途径的中间产品，如2-酮戊二酸盐也可用作起始物。本领域的技术人员应当理解，在此示例的工程路径是相对于，但并不限于，菌种的特定基因并包括核酸或氨基酸序列的同源染色体或同源基因。当利用本领域已知方法进行比对时，同源染色体和同源基因序列拥有高度的序列一致性/相似性。本专利技术的方法和微生物的特征涉及“基因修饰”或重组的微生物或宿主细胞，所述微生物或宿主细胞经过工程改造而具有新的代谢功能或新代谢途径。此处使用的术语“基因修饰”的微生物包括具有至少一种基因改变的微生物，例如重组基因的表达，而在引用的菌种的野生株中通常不存在这种基因改变。在一些实施例中，将基因工程微生物在代谢途径的关键点上进行工程改造来表达或过度表达至少一种特定酶，和/或抑制或限制其他酶的活性，以克服或避免代谢瓶颈。我们提供了基因修饰宿主细胞或微生物，以及利用其由α-酮酸制备己二酸和己二酸盐的方法。此处所述的“宿主细胞”是指真核细胞、原核细胞或来源于作为单细胞实体进行培养的多细胞生物(如细胞系)的细胞。所述宿主细胞可以是原核的(如细菌如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌)或真核的(如酵母菌、哺乳动物或昆虫细胞)。例如，宿主细胞可以是细菌细胞(如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，分支杆菌，结核分支杆菌，或其他合适的细菌细胞)，古生菌(例如甲烷球菌或海藻甲烷球菌或其他合适的古细胞)，酵母菌细胞(例如酵母属菌种，如啤酒酵母、粟酒裂殖酵母、Picchia酵母，念珠菌属如白色念珠菌，或其他合适的酵母菌种)。优选宿主细胞包括大肠杆菌。代谢工程细胞可通过向宿主细胞中转导入至少一种编码包含在工程代谢途径中的酶的核苷酸序列来获得。此处所述“核苷酸序列”、“核酸序列”和“遗传结构”可相互替换使用，并且表示RNA或DNA的聚合体，单链或双链，可选地包含合成的、非天然的或经改变的核苷酸碱基。核苷酸序列可包含一个或多个cDNA、基因组DNA、合成DNA或RNA的片段。在优选实施例中，编码代谢过程中的酶或蛋白质的核苷酸序列是经过密码子优化的，从而反映宿主细胞的典型的密码子选择而不改变通过核苷酸序列编码的多肽。在优选实施例中，术语“密码子优化”或者“密码子优化的”是指修饰核酸序列的密码子内容，而不修饰该核酸编码的多肽序列，以增强在特定宿主细胞中的表达。在优选实施例中，该术语旨在包含通过修饰核酸序列的密码子内容的方法来控制多肽的表达水平(如提高或降低表达水平)。在一些实施例中，代谢工程细胞可表达一种或多种具有酶活性的多肽，而这些酶活性是实施下述步骤所必须的。比如，特定细胞可包含一、二、三、四、五或更多个核酸序列，每个核酸序列都编本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备己二酸盐或己二酸的方法，所述方法包括：a)缩合2‑酮戊二酸或其盐与乙酰辅酶A制得高柠檬酸或其盐；b)通过至少一个化学反应使高柠檬酸或其盐转化为己二酸盐或己二酸；以及c)可选地，分离己二酸盐或己二酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.09.14 US 61/701,0961.一种制备己二酸盐或己二酸的方法，所述方法包括：
a)缩合2-酮戊二酸或其盐与乙酰辅酶A制得高柠檬酸或其盐；
b)通过至少一个化学反应使高柠檬酸或其盐转化为己二酸盐或己二酸；以及
c)可选地，分离己二酸盐或己二酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个化学反应包括：
a)高柠檬酸或其盐脱羧基制得3-羟基己二酸或其盐；
b)3-羟基己二酸或其盐脱水制得己烯二酸或其盐；以及
c)氢化己烯二酸或其盐制得己二酸盐或己二酸。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个化学反应包括：
a)高柠檬酸或其盐脱羧基制得3-羟基己二酸或其盐；
b)氢化3-羟基己二酸或其盐制得己二酸盐或己二酸。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少一个化学反应包括：
a)高柠檬酸或其盐脱羧基制得3-酮己二酸或其盐；
b)氢化或还原3-酮己二酸或其盐制得3-羟基己二酸或其盐；
c)3-羟基己二酸或其盐脱水制得己烯二酸或其盐；以及
d)氢化己烯二酸或其盐制得己二酸盐或己二酸。
5.一种制备己二酸盐的方法，所述方法包括：
a)准备高柠檬酸或其盐；
b)高柠檬酸或其盐脱羧基制得3-酮己二酸或其盐；以及
c)氢化3-酮己二酸或其盐制得己二酸盐或己二酸。
6.一种制备己二酸盐或己二酸的方法，所述方法包括：
a)准备高柠檬酸或其盐；
b)处理高柠檬酸或其盐制得高柠檬酸内酯或其盐；
c)高柠檬酸内酯或其盐脱氢制得4-羧基-粘康酸内酯或其盐；
d)4-羧基-粘康酸内酯或其盐脱羧基制得5-羧基-丁内酯-4-烯或其盐；
e)5-羧基-丁内酯-4-烯或其盐互变异构制得3-酮己二酸或其盐；以及
f)氢化3-酮己二酸或其盐制得己二酸盐或己二酸。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述至少一个化学反应包括：
a)高柠檬酸或其盐脱羧基制得3-酮己二酸或其盐；
b)3-酮己二酸或其盐酯化制得3-酮己二酸的单酯或二酯或其盐；
c)氢化3-酮己二酸的单酯或二酯或其盐制得己二酸的单酯或二酯或其盐；以及
d)可选地，水解己二酸的单酯或二酯制得己二酸。
8.一种制备己二酸盐的方法，所述方法包括：
(a)可选地在至少一种惰性溶剂存在的条件下，使包含3-羟基己二酸或其盐的反应
物与氢气和多相催化体系相接触，所述多相催化体系既作为酸催化剂又作为氢化催化
剂，反应温度为75℃至300℃，氢气压力为345kPa至20.7MPa，制得包含己二酸
或其盐的反应产物；以及
(b)从反应产物中回收己二酸或其盐。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述多相催化体系包括：
(a)至少一种非负载型或负载型固体酸催化剂，其中，固体酸催化剂选自：(1)异
构杂多酸及其盐，(2)天然粘土矿物，(3)阳离子交换树脂，(4)金属氧化物，(5)混
合的金属氧化物，(6)金属盐，和(7)上述(1)至(6)的组合；以及
(b)至少一种非负载型或负载型氢化催化剂，其中，氢化催化剂选自以下金属：镍、
铜、铬、钴、铑、钌、铼、锇、铱、铂、钯、铂黑，上述金属混合物，以及它们的组合。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括使己二酸盐转化为己二酸以及可选地
分离己二酸。
11.一种制备己二酸或其盐的方法，包括：
a)准备工程微生物表达：
i)至少一种酶，催化反应底物2-酮戊二酸或其盐和乙酰辅酶A发生转化，...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·R·米尔斯，刘曼杰，
申请(专利权)人：生物琥珀酸有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US