人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和应用制造技术

本发明专利技术提供了人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备及其应用。所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。本发明专利技术将得到的人组织先切成薄片后再进行脱细胞操作，在保证脱细胞彻底性的同时极大的缩短了脱细胞时间，从而节省了大量的时间，确保今后商品化的可能。本发明专利技术中还发现了人心脏瓣膜脱细胞基质在体外细胞培养中具有促进干细胞黏附，增殖及心肌方向分化的作用，移植到心梗心脏表面可以有效改善心功能，因此可以作为新的体外细胞培养介质及移植物用于心脏病干细胞治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及心脏组织脱细胞基质的制备及其在细胞培养及组织工程的基础研究及应用，属于生物医药，组织工程学，细胞生物学，干细胞生物学及心脏大血管外科领域。
技术介绍
心血管疾病是一个全球性的健康问题。世界上大约三分之一的人是死于心血管疾病。心肌梗死及充血性心力衰竭是心血管疾病导致死亡的主要原因，而心肌梗死又是引起充血性心力衰竭的重要原因。对于心肌梗死的治疗目前主要是恢复缺血区周围心肌组织的血流量，一般采取药物护心、冠状动脉支架植入和实施搭桥手术等传统方法，但这些治疗措施只能保护残存的心肌，对已梗死的心肌无法修复。而心脏移植的供体不足和强烈的免疫反应以及高昂的治疗费用，故难以在临床上大范围应用。最近研究显示应用骨髓干细胞移植可改善心肌修复，具有传统治疗方法所无可比拟的优越性，为治疗心肌梗死提供了一种全新治疗前景。骨髓干细胞在心肌再生及心脏损伤修复中已有成功的报道。C-kit作为心脏干细胞标记物，已有报道显示小鼠c-kit阳性骨髓干细胞移植入梗死心肌周边区后发现在梗死区重新产生新的心肌细胞，梗死区及周边毛细血管密度显著增加。这一重要发现提供了骨髓干细胞能分化为心肌细胞和血管的初步实验依据。目前利用骨髓干细胞修复心脏损伤的研究中主要采用的是细胞移植的方法，将骨髓细胞直接移植到心梗区中。心肌细胞作为分化成熟的细胞自身的损伤后很难再生，而仅仅通过干细胞原位注入治疗的效果有限。而心肌细胞是存在于大量外基质(ECM)中的，其主要成分是心肌间隙中成纤维母细胞产生和分泌的胶原纤维，对维持心脏正常的形态和功能起重要作用，心肌胶原纤维相互交织，形成多层次、多方位、复杂的三维空间结构，在支持、保护心肌细胞、协调心肌收缩、舒张等方面发挥重要作用。因此，给骨髓细胞提供一个心脏的基质环境可以更有助于其对心肌缺损的修复。脱细胞材料由于其成分最接近与相对应的组织的成分，所以其应用越来越广泛。然而因为细胞不易脱净，应用较多的都是膜状的组织的脱细胞基质材料，如羊膜，小肠粘膜下层(SIS)等。而心脏这样的实质性器官并未见脱细胞基质研究。然而羊膜，真皮，小肠粘膜下层这些膜状组织，其胶原纤维层次及结构与心脏组织相差甚远，并不能提供相似于心脏的基质环境。本专利技术创立了薄片状的脱细胞方法，可以解决传统的实质性组织脱细胞方法耗时较长，很难将中间部分的细胞脱尽的问题，切成膜片后由于膜片厚度接近于细胞的直径，故组织中的细胞大部分能够暴露在脱细胞溶液中，较容易脱尽细胞，耗时可以大大缩短。再者，膜片形式的构建细胞也能解决细胞难以进入材料的问题，使细胞更好的材料复合。因此本专利技术提出：将人心脏瓣膜切成薄片的形式，进行脱细胞处理，切成膜片的组织较易脱尽细胞。将脱细胞基质及骨髓c-kit阳性干细胞复合制成复合补片，利用脱细胞基质提供生物信号，提高细胞增殖、黏附、分泌等生物学特性。细胞，并用其修复心肌损伤，心肌损伤修复改善明显。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质及其制备和用途。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，其制备方法包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。优选地，所述的心脏瓣膜组织来自瓣膜置换术患者的废弃瓣膜组织。优选地，所述的脱细胞处理包括：将所得的薄片加入离心管中，加入质量分数为0.5～1.5％的十二烷基硫酸钠(SDS)，放入温度为36～38℃、转速为150～200r/min的摇床中消化12～24h，洗涤，得到消化后的人心脏瓣膜组织，加入150～250mg/L DNA酶I溶液，反应2～6小时，洗涤，得到心脏瓣膜脱细胞基质。本专利技术还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法。本专利技术还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为组织工程支架在制备组织工程移植物中的应用。优选地，所述的组织工程移植物为用于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重构的组织工程移植物。本专利技术还提供了上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附、存活、增殖和心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构中的应用。本专利技术还提供了一种心脏补片(或称心脏移植物或心肌补片)，其特征在于，包含种子细胞以及上述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质。优选地，所述的种子细胞为骨髓来源的c-kit+细胞骨髓单个核细胞、间充质干细胞、心肌去分化细胞、心肌干细胞及胚胎干细胞来源的细胞(如人来源的干细胞)中的至少一种。本专利技术还提供了上述的心脏补片的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：将种子细胞种于上述人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法所制备的人心脏瓣膜组织脱细胞基质上，培养得到心肌补片。优选地，所述的种子细胞为c-kit阳性细胞。更优选地，所述的c-kit阳性细胞为小鼠骨髓来源的c-kit阳性的细胞，其制备方法包括：取心梗3天后的小鼠的胫骨和肱骨，用Hanks平衡盐溶液冲出骨髓，分离出骨髓单个核细胞，磁珠分离得到c-kit阳性细胞。优选地，所述的培养步骤包括用含有10％～25％的FBS的IMDM培养基在含3～8％CO2的36～38℃培养箱培养5～15天。更优选地，所述的培养过程中每隔2～3天换半量换培养液。本专利技术验证了此心脏补片对心功能的修复状况以及心脏组织脱细胞基质作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附，存活，增殖，心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：1、本专利技术将得到的人组织先切成薄片后再进行脱细胞操作，在保证脱细胞彻底性的同时极大的缩短了脱细胞时间，从而节省了大量的时间，确保今后商品化的可能。人来源心脏组织脱细胞基质体外具有促进细胞黏附，增殖及其向心肌方向分化的能力，与合成材料相比，更能充分模拟人心肌细胞生长微环境，具有更适宜的生长及诱导环境。因此可以作为细胞体外培养介质提供促进细胞黏附，存活，增殖，心脏方向分化的微环境及细胞外基质架构。2、c-kit阳性细胞作为骨髓中一群干细胞已经被证实可向心肌，平滑肌，内皮细胞方向分化，在心梗修复中发挥重大作用。C-kit阳性细胞在体外无法长期存活，增殖能力差，对于细胞治疗来说无法达到足够的细胞数量。本专利技术中心脏组织脱细胞基质在体外可以促进c-kit阳性细胞大量增殖，从而为细胞治疗创造可以获得足够种子细胞的方法。本专利技术首次将骨髓来源的c-kit阳性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，其制备方法包括：将人的心脏瓣膜组织切成厚度为50‑100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。

【技术特征摘要】
1.一种人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，其制备方法包括：将人
的心脏瓣膜组织切成厚度为50-100μm的薄片；将所得的薄片进行脱细胞处理，
得到心脏瓣膜脱细胞基质，冷冻干燥、消毒备用。
2.如权利要求1所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质，其特征在于，所述的
脱细胞处理包括：将所得的薄片加入离心管中，加入质量分数为0.5～1.5％的十
二烷基硫酸钠，放入温度为36～38℃、转速为150～200r/min的摇床中消化12～
24h，洗涤，得到消化后的人心脏瓣膜组织，加入150～250mg/L DNA酶I溶液，
反应2～6小时，洗涤，得到心脏瓣膜脱细胞基质。
3.权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质的制备方法。
4.权利要求1或2所述的人心脏瓣膜组织脱细胞基质作为组织工程支架
在制备组织工程移植物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的组织工程移植物为用
于修复缺血性心肌损伤、改善心脏功能、改善心力衰竭或其他原因造成的心肌重
构的组织工程移植物。
6....

【专利技术属性】
技术研发人员：陈瑶，万龙，李军，薛松，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31