用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记、引物、试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术涉及一种用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记、引物、试剂盒和检测方法，采用SSR-PCR技术，获得了2000bp左右大小的脱氧核糖核酸差异表达的片段。对该片段用细菌质粒M13进行克隆，用核酸自动分析序列仪测定其碱基序列为2165bp。以此序列为依据，人工合成了一对寡聚核苷酸引物具有可以检测烤烟材料钾含量的高低，即检测烟叶中与钾相关基因的表达，可用作烤烟育种中检测钾相关基因的探针。本发明专利技术操作简单、结果可靠、检测速度快速、不受植株生长发育时期和环境的影响，可大大提高鉴定效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，涉及一种用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记、引物、试剂盒和检测方法。
技术介绍
根据大量资料统计，钾是烤烟吸收量和体内含量最高的营养元素，也是影响我国烤烟质量进一步提高的重要限制因素。而我国大多数植烟土壤不能提供充足的钾供给烤烟以满足优质烟叶生产的需求。因此，生产上需要投入大量的钾肥。连年大量施用化肥，不但增加烟农的生产成本，而且加速土壤理化性质的恶化。遗憾的是我国优质烟叶平均钾含量依然较低，与国外优质烟叶相比至少还低20％以上(我国优质烟叶2％左右，国外优质烟叶大2.5％)。影响烤烟体内钾含量的因素有许多，主要有：土壤和气候；栽培措施；品种或基因型等。土壤和气候是自然形成的，人类较难改变。栽培措施提高烟叶钾含量，多年实践证明有一定的局限性，何况再增加钾肥用量也不可取。因此，选育高钾含量烤烟新品种将是解决烤烟钾含量的关键途径之一。然而选育高钾含量烤烟时需要对成熟期的叶片进行化学分析，所需时间比较长；荧光定量RT-PCR(实时荧光定量PCR)技术是在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号监测整个PCR反应的进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量的方法。1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且还具有特异性强、能有效解决PCR污染问题和自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术的不足，提供一种荧光定量RT-PCR检测钾相关基因在烟草叶片中的表达情况，从而检测烟草叶片中钾含量的高低。一种用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记，序列如SEQ NO:1。一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的RT-PCR扩增方法所用的引物，序列如下：正向序列F：5’-CCCTTATGTC AGCACCAGAA-3’；反向序列R：5’-GCTGGCAACTGTGGA AGGAT-3’。一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的试剂盒，包括所述的引物，以及进行RT-PCR反应所需的各种试剂。RT-PCR反应所需的各种试剂包括：10×Buffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的RT-PCR扩增方法，首先提取待检测烤烟的RNA，然后在反转录酶的作用下将其RT-PCR反转录成cDNA，最后以烟草cDNA为模板，以权利要求2所述的核酸分子为引物，进行PCR扩增，扩增出2165bp大小的DNA片段，表明被检测烤烟拥有钾相关基因存在与表达，然后根据荧光值变化曲线和融解曲线计算烟叶的含钾量。PCR体系包括12.5μL SYBR Green Realtime PCR Master Mix，10μmol L–1PCR上下游引物各0.5μL，100ng/μL模板cDNA5μL，补蒸馏水至总体积25μL。PCR反应条件：50℃25min→5个循环：包括95℃30s和65℃30s→30个循环：包括95℃5s和55℃35s。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的，其步骤如下：1、采用SSR分子标记技术，用其100个引物(PT20189-PT20288，购自上海生工)对所用烤烟材料进行PCR扩增，其中引物PT20287可以扩增区分出高钾和低钾含量的烤烟烟叶，其大小约为2000bp左右(图1)。2、用细菌质粒M13对在步骤1中获得的序列进行克隆后，用核酸自动分析序列仪测定该标记的碱基构成及其序列；3、对步骤2中测定的DNA进行序列分析，并按照所获序列为依据，利用DNA合成仪，人工合成寡聚核苷酸(正向序列F 5’-CCCTTATGTC AGCACCAGAA-3’；反向序列R5’-GCTG GCAACT GTGGAAGGAT-3’)；4、利用步骤3中的引物对8个烤烟材料cDNA进行RT-PCR扩增后进行电泳检测，结果表明高钾含量烤烟材料的DNA浓度在2165bp处较高，而低钾含量烤烟材料则较低(图2)。5、对步骤4中进行RT-PCR扩增后的产物进行荧光值变化曲线和融解曲线分析，定量计算不同材料与钾相关基因的表达量。本专利技术的积极效果是：首次根据不同烤烟SSR的多态性设计特异引物，通过实时荧光定量PCR检测序列在烟草叶片中的表达情况，从而检测烟草叶片中钾含量的高低。附图说明图1为SSR-PCR扩增的多态性；图2为RT-PCR扩增产物的电泳检测；序号1-8分别为GK7、K326、红花大金元、GK2、云烟87、GK8、云烟97、GK5；图3荧光值变化曲线；图4为融解曲线。具体实施方式以下实施例旨在进一步说明本专利技术，而非限制本专利技术。实施例1：本专利技术方法实施的过程(1)烤烟材料的准备：将8个烤烟材料的种子播种于漂浮育苗盘中，当烟苗生长到3-4片真叶时，每个材料叶片取10g左右。(2)基因组DNA的提取：利用CTAB法提取基因组DNA，将冷冻干燥的烟草叶片研磨成粉末，加入65℃预热的CTAB抽提液，65℃保温45min以上，间或轻摇混匀→12000r/min室温离心20min后取上清液→加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，轻轻混匀15min以上，12000r/min室温离心20min，取上清液移入新离心管中→加入预冷的异丙醇，轻轻摇动5min，8000r/min室温离心10min后去上清→沉淀用75％乙醇和10mmol/L KAC抽提2～3次(每次8000r/min室温离心10min)→加入预冷的95％乙醇，轻轻上下颠倒，12000r/min室温离心20min后弃乙醇，真空抽干或自然晾干→加入200uL TE buffer，轻轻敲打使沉淀溶解→加入1ul 10mg/mL Rnase 37℃水浴，保温1h，去除RNA→DNA提取物放于-20℃冰箱中贮藏备用。(3)PCR扩增：以烤烟基因组DNA为模板进行SSR-PCR扩增，PCR体系包括10×Buffer、0.2mmol/L dNTP、2.0mmol/L MgCL2、2U TaqDNA聚合酶、50ng模板DNA、引物0.5umol/L；加水至25uL。PCR反应条件：前12个循环为94℃预变性2min→94℃变性30s→65℃退火30s(以0.7℃/每个循环的速度上升)→72℃延伸1min；后23个循环为94℃变性30s→56℃退火30s→72℃延伸1min→72℃延伸5min；其中所用引物编号为PT20189-PT20288。(4)电泳检测和测序：扩增后的产物用电泳检测，扩增出约2000bp本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记，其特征在于，序列如SEQ NO:1。

【技术特征摘要】
1.一种用于快速检测烤烟烟叶钾含量高低的分子标记，其特征在于，序列如SEQ NO:1。
2.一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的RT-PCR扩增方法所用的引物，其特征在于，序列如
下：正向序列F：5’-CCCTTATGTC AGCACCAGAA-3’；
反向序列R：5’-GCTGGCAACTGTGGA AGGAT-3’。
3.一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述的引物，
以及进行RT-PCR反应所需的各种试剂。
4.根据权利要求3所述的快速检测烤烟烟叶钾含量高低的试剂盒，其特征在于，RT-PCR反
应所需的各种试剂包括：10×Buffer、dNTP、MgCl2、TaqDNA聚合酶。
5.一种快速检测烤烟烟叶钾含量高低的RT-PCR扩增方法，其特征在于，
首先提取待检测烤烟的RNA，然后在反转录酶的作用下将其RT...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟军，戴林建，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43