能够产生腺伴随病毒载体的细胞制造技术

按照本发明专利技术，可以使用人工导入了能够表达miRNA的核酸的细胞，产生与常规载体的滴度相比滴度较高的AAV载体。使用所述细胞产生的AAV载体和含有所述病毒载体作为活性成分的组合物作为在基因疗法的研究或临床实践中的基因转移方法是非常有用的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在基因疗法的研究或临床领域中特别用于将基因转移进入人体中的能够产生具有高滴度的腺伴随病毒载体的细胞。专利技术背景目前，为了治疗癌症或感染以及治疗先天性遗传疾病，进行了使用病毒载体的基因疗法的许多尝试。在许多情况下，作为病毒载体，按惯例使用反转录病毒载体或腺病毒载体。腺伴随病毒(AAV)是线性单链DNA病毒，可感染大范围物种(包括人)的细胞。AAV还感染其中分化终止的不发生细胞分裂的细胞，包括血细胞、肌肉细胞、神经细胞等。另外，因为AAV对人类不是致病性的，所以具有低的不良反应的风险，并且AAV的病毒颗粒是稳定的。出于这些原因，近来开发用于基因转移的AAV载体在继续进行之中。为了产生用于基因转移的AAV载体，正如其它病毒载体一样，在形成病毒颗粒所需要的存在于野生型AAV基因组的元件中，将需要以顺式提供的元件和可以反式提供的元件分别导入用于病毒产生的细胞中和使它们在细胞中表达，因此防止在被AAV载体感染的宿主中野生型AAV的产生和AAV载体的自我复制(专利文献1)。用于产生AAV载体的已确立的常规方法包括：1)将其中保留置于野生型AAV基因组各端的ITR并剔除rep和cap基因的AAV载体质粒导入，2)导入用于表达rep和cap基因的质粒以便以反式提供Rep和Cap蛋白，并且，因为AAV需要提供来自所谓辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或痘苗病毒)的补充元件用于形成感染性病毒颗粒，所以3)用腺病毒感染(专利文献2)。然而，通过上述方法获得的AAV载体从理论上说被腺病毒污染。腺病毒污染物必须排除或灭活，这是造成AAV载体滴度降低的原因。另外，对将被腺病毒污染的AAV载体给予人可能引起副作用(例如腺病毒感染或炎症)存有担忧。因此，开发了一种用于产生AAV载体的方法，其包括：用以替代上述步骤3)的步骤3')导入在腺病毒来源的元件中只表达形成AAV病毒颗粒所必需的元件的辅助质粒(无辅助病毒系统(Helper-free system)) (专利文献3)。按照所述方法产生的AAV载体不被腺病毒污染，因此是极安全的。另一方面，对于预期用于基因疗法的研究或临床领域的AAV载体的产生，必须获得具有高滴度的病毒载体溶液。为此，根据来源于人的HeLa细胞或A549细胞产生恒定表达rep和cap基因的细胞系，并进行了控制这些基因的表达水平的尝试。然而，由此获得的AAV载体没有足够的滴度。因此，需要用于产生具有较高滴度的AAV载体的方法。引用文献列表专利文献专利文献1：USP6093570专利文献2：WO97/06272专利文献3：WO97/17458。专利技术概述本专利技术要解决的问题本专利技术的目的是提供在没有复杂操作的情况下获得具有高滴度的AAV载体溶液的细胞和包括使用所述细胞产生AAV载体的方法和试剂盒。解决问题的技术方案如上所述，对于预期用于基因疗法的研究或临床领域的AAV载体的产生，需要能够产生具有较高滴度的AAV载体的方法。本专利技术人潜心研究并最终发现，在产生AAV载体时，通过使用表达人工导入的miRNA (例如hsa-miR-196a1、hsa-miR-324或hsa-miR-342)的细胞，获得具有高于通过常规方法获得的载体的滴度的AAV载体。因此，完成了本专利技术。本专利技术概述如下。本专利技术涉及：[1] 一种能够产生AAV载体的细胞，其中表达人工导入的miRNA，[2] [1]的细胞，其中人工导入的miRNA是选自hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的至少一种，[3] 一种产生AAV载体的细胞，其是导入了待包封入病毒中的核酸的[1]或[2]的细胞，[4] 一种用于产生AAV载体的方法，所述方法包括培养[3]的细胞的步骤，[5] 一种用于产生AAV载体的试剂盒，其包含用于提供miRNA的核酸和用于提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸，[6] 一种通过[4]的方法可获得的AAV载体，[7] 一种通过在产生AAV载体的细胞中表达miRNA来选择可引起产生AAV载体的细胞产生AAV载体的能力提高的miRNA的方法，所述方法包括制备表达miRNA的AAV载体的混合物的步骤和选择在细胞中大量产生的AAV载体的步骤，和[8] [7]的方法，所述方法包括下列(a)-(e)的步骤：(a) 获得表达miRNA的AAV载体的混合物的步骤；(b) 用表达miRNA的AAV载体的混合物感染细胞的步骤；(c) 培养通过步骤(b)获得的细胞以获得由细胞产生的AAV载体混合物的步骤；(d) 使用通过步骤(c)获得的AAV载体混合物重复步骤(b)和(c)一次或多次的步骤；和(e) 获得编码在通过步骤(d)获得的AAV载体混合物中的miRNA的核酸的步骤。专利技术效果按照本专利技术，提供能够产生AAV载体的细胞。通过使用所述细胞，可在没有复杂操作的情况下产生具有高于通过常规方法获得的载体的滴度的AAV载体。另外，提供包括使用所述细胞产生AAV载体的方法和试剂盒。具体实施方式能够产生本专利技术的AAV载体的细胞(下文亦称为本专利技术的细胞)是表达产生AAV载体所必需的元件和人工导入的miRNA的细胞。本专利技术的产生AAV载体的细胞是导入了待包封入病毒颗粒中的核酸的本专利技术细胞。为了产生本专利技术的细胞，待用作材料的细胞不受特别限制。细胞的实例包括哺乳动物(例如人、猴和啮齿动物)的细胞，其优选的实例包括293细胞(ATCC CRL-1573)、293T细胞(ATCC CRL-11268)、293F细胞、293FT细胞(全部都由Life Technologies生产)、G3T-hi细胞(WO06/035829)和用于AAV载体产生的市购可得的细胞系，例如AAV293细胞(由Stratagene Corp.生产)，其具有高的转化效率并恒定表达腺病毒E1基因。此外，可以使用经修饰以瞬时或恒定表达AAV载体产生所必需的一些蛋白质的细胞。产生AAV载体所必需的元件的实例包括：(A) AAV来源的Rep和Cap蛋白，和(B)腺病毒来源的元件，例如E1a、E1b、E2、E4、VA RNA基因。用于向本专利技术细胞提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸的实例包括：(a)编码Rep蛋白的核酸、编码Cap蛋白的核酸，和(b)编码腺病毒来源的元件的核酸。这些核酸的形式不受限制。可将作为能够为所用细胞提供各种元件的一个或多个核酸构建体的这些核酸插入质粒或病毒载体中，然后可将核酸构建体导入细胞中。例如，使用市购可得的pAAV-RC1质粒和pHelper质粒(由Cell Biolabs, Inc.生产)。编码Cap蛋白的核酸在不同于编码的Cap蛋白的可读框中编码形成AAV颗粒所必需的装配激活蛋白(assembly-activating protein，AAP) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2010, 第107卷, 第10220-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种能够产生AAV载体的细胞，其中表达人工导入的miRNA。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.06 JP 2012-1521241. 一种能够产生AAV载体的细胞，其中表达人工导入的miRNA。
2. 权利要求1的细胞，其中所述人工导入的miRNA是选自hsa-miR-196a1、hsa-miR-324和hsa-miR-342的至少一种。
3. 一种产生AAV载体的细胞，其是导入了待包封入病毒中的核酸的权利要求1或2的细胞。
4. 一种用于产生AAV载体的方法，所述方法包括培养权利要求3的细胞的步骤。
5. 一种用于产生AAV载体的试剂盒，其包含用于提供miRNA的核酸和用于提供形成AVV载体的病毒颗粒所必需的元件的核酸。
6. 一种通过权利要求4的方法可获得的AAV载体。
7. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：西江敏和，高岛扶有子，榎龙嗣，峰野纯一，
申请(专利权)人：宝生物工程株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP