用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用技术

本发明专利技术提供用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用，涉及微生物生物技术领域。所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。制备细菌素durancin GL方法如下，诱导重组菌表达融合蛋白，破碎得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解，除去纯化标签，得到细菌素durancin GL。本发明专利技术重组菌构建方便，能够高效表达重组细菌素durancin GL，通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物生物
，具体涉及用于制备细菌素durancin GL的重组菌、制备方法及应用。
技术介绍
细菌素是一类由核糖体产生的具有抑菌活性的蛋白质或多肽，在革兰氏阳性和革兰氏阴性菌中广泛存在，其对目标细菌的抑制具有低浓度和高效性的特点。在对化学防腐剂的安全隐患越来越重视的今天，食品级微生物来源的细菌素作为生物防腐剂的应用符合消费者对于安全、健康和天然的要求。来源于耐久肠球菌、能够专一性抑制李斯特菌的细菌素durancin GL，在食品工业中具有重要的潜在应用价值。采用耐久肠球菌发酵制备细菌素durancin GL，发酵液中目标产物浓度较低，发酵液成分复杂，因此分离有活性细菌素的过程耗时费力，成本高，且纯度难以保证。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于制备细菌素durancin GL的重组菌，该重组菌构建方便，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。本专利技术的另一目的是提供所述重组菌的制备方法，该方法简单，效率高。本专利技术的再一目的是提供制备细菌素durancin GL的方法，诱导培养重组菌后，仅需要通过简单的亲和色谱就能够高效分离重组细菌素durancin GL，水解后除去标签蛋白，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。本专利技术提供用于制备细菌素durancin GL的重组菌，所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。在本专利技术中，所述纯化标签通过酶切位点连接在细菌素durancin GL的一端或两端。优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。另一优选的技术方案中，所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。本专利技术还提供所述重组菌的制备方法，将由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体得到重组载体；将所述重组载体转化大肠杆菌，得到所述重组菌。优选的技术方案中，所述重组载体是将由细菌素durancin GL、酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因插入表达载体pGEX-6P-1后获得。本专利技术还提供制备细菌素durancin GL的方法，诱导所述重组菌表达由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，破碎所述重组菌得到裂解液，离心取上清液，采用HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱分离或者采用GSTrap 4B柱分离，收集洗脱峰，采用肠激酶酶解所述由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白，除去酶解液中的纯化标签，得到细菌素durancin GL。本专利技术巧妙构建了制备细菌素durancin GL的重组菌，在诱导条件下能够高效表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，菌体裂解液成分简单，有利于通过亲和色谱进行高效分离，水解酶切位点后得到具有活性的细菌素durancin GL。本专利技术制备细菌素durancin GL的方法，是通过诱导重组菌表达带有纯化标签的重组细菌素durancin GL，然后采用亲和色谱分离，水解并除去纯化标签，就能够获得大量、高纯度、有活性的细菌素，该细菌素的结构和功能与天然durancin GL完全一致。携带有GST标签和His标签的重组细菌素durancin GL的分离纯化效果显著好于仅含有GST标签的重组细菌素durancin GL，前者得到的具有活性的细菌素durancin GL的纯度也显著大于后者所得细菌素durancin GL。以下结合说明书附图对本专利技术作进一步的描述。附图说明图1为携带有细菌素durancin GL基因的重组表达载体构建过程，其中durAB为细菌素durancin GL的基因（包括结构和免疫基因），Ptac为乳糖操纵子和色氨酸操纵子的杂合启动子；GST为GST标签编码基因的缩写，His是His标签编码基因的缩写。图2 重组菌1的重组durancin GL粗提液采用HisTrap HP柱分离纯化的色谱图。图中横坐标为流过色谱柱的流动相体积，单位为mL；纵坐标为流出液在280 nm波长下的吸收值，单位为mAU。箭头所示吸收峰的出现表明重组durancin GL被有效的分离出来。图3  HisTrap HP柱或GSTrap 4B柱一步分离纯化重组细菌素durancin GL的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液，泳道2为重组菌1的重组细菌素durancin GL粗提液经HisTrap HP柱一步分离纯化得到的重组细菌素durancin GL，泳道3为重组菌2的重组细菌素durancin GL粗提液经GSTrap 4B柱一步分离纯化得到的重组细菌素durancin GL。图中箭头所示的条带为目标蛋白所在的位置，其余条带为杂蛋白。图4  经HisTrap HP柱和GSTrap 4B柱两步纯化获得的重组菌1的重组细菌素durancin GL的SDS-PAGE电泳结果。泳道2为蛋白质Marker，从上到下各条带分子量依次为97.4 kDa，66.2 kDa，43 kDa，31 kDa。图5是重组细菌素durancin GL切除纯化标签后的活性检测结果。具体实施方式下述实施例中使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。下面以pGEX-6p-1载体为例，对本专利技术作进一步的详细说明。pGEX-6P-1载体（可以通过商业途径购买获得）由本实验室保藏，pGEX-6P-1载体携带有GST标签的编码基因。实施例11、细菌素durancin GL基因的克隆    根据GenBank数据库中细菌素durancin GL基因的序列（HQ696461.1），设计引物dur1（SEQ ID NO:5）：5′-ggg agg caa tta tat gaa gaa aaa att tgt tag tat t-3′和dur2（SEQ ID NO:6）：5′-CCA gTg CCC CCA TAA ACT ATA CAC CC-3′，从耐久肠球菌41D（是已经公开的细菌）中扩增细菌素durancin GL的基因片段，该片段由结构基因和免疫基因组成，序列如SEQ ID NO:1所示。    细菌素durancin GL的基因也可以采用化学合成的方法制备。2、细菌素durancin GL基因片段的序列验证...

【技术保护点】
用于制备细菌素durancin GL的重组菌，其特征在于所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。

【技术特征摘要】
1.用于制备细菌素durancin GL的重组菌，其特征在于所述重组菌携带由细菌素durancin GL、纯化标签和酶切位点相连形成的融合蛋白的编码基因。
2.根据权利要求1所述重组菌，其特征在于所述纯化标签通过酶切位点连接在细菌素durancin GL的一端或两端（N端或C端或者同时连接在N和C端）。
3.根据权利要求2所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，或者所述纯化标签是由GST标签通过酰胺键与His标签相连而成；所述酶切位点是肠激酶酶切位点。
4.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签通过酰胺键与His标签相连而成，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
5.根据权利要求3所述重组菌，其特征在于所述纯化标签是GST标签，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
6.权利要求1-5之一所述重组菌的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：鞠兴荣，陈信全，都立辉，袁建，何荣，和肖营，吴学友，刘凌平，施荣华，
申请(专利权)人：南京财经大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32