一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白的DNA序列及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白的DNA序列，所述DNA序列包括：a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。本发明专利技术还提供了含有上述核苷酸序列的重组表达载体和基因工程化的宿主细胞及其用途。本发明专利技术的优点在于：筛选获得了缺刻缘绿藻油体钙蛋白基因的cDNA全长序列和DNA全长序列，通过将该基因在真核模式生物酵母BY4741菌株中与增强型黄色荧光蛋白(eYFP)融合表达该基因，发现该基因编码蛋白确实定位在酵母细胞的油体上，从而证实了MiClo基因所编码的蛋白能准确地锚定于油体上，具有维持油体结构完整性的功能。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，具体地说，涉及一种编码缺刻缘绿藻油体钙蛋白(MiClo)的DNA序列及其应用。
技术介绍
能源是人类社会发展的基础。目前全球正面临着能源危机，石油资源供应紧张，而可再生性使生物能源的开发越来越受到社会的关注。微藻生物柴油以其不与人争粮、不与粮争地、不与畜争料的独特优势吸引了越来越多科研工作者的关注。为了提高各种油料作物的产油量，油体(oil body,OB)以及油体结合蛋白(protein associated oil bodies)逐渐成为植物生物技术的新研究目标。不同种类的微藻积累油滴的能力不同，其中绿藻、硅藻等真核微藻的油脂含量比较高，有希望成为生物柴油的生产藻种。实验中所使用的缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl H4301)是一种淡水单细胞微藻，隶属绿藻门(Chlorophyta)。该藻能大量积累三酰甘油(TAG)，尤其是在缺氮条件下，这些TAG包裹在半单位膜内以油滴的形式存在于细胞中，是潜在的微藻生物柴油藻种。细胞的油体也称脂质体(lipid body,LB)或脂滴(lipid droplet,LD)，它们将为细胞的未来生长提供所贮存的碳源和能量。细胞内的油体为了避免与质膜及细胞内膜的融合，在其半单位膜上镶嵌着油体结合蛋白。研究表明，这些油体结合蛋白中的油体钙蛋白(caleosin)主要存在于真菌或者单细胞藻类，而油质蛋白(oleosin)主要存在于高等植物中。某些低等植物例如藓类、苏铁类等植物也是以油体钙蛋白而不是油质蛋白作为它们的主要油体结合蛋白。这表明油体钙蛋白具有维持油体结构完整性的保守功能。植物特别是其种子中的油体可用来表达高附加值的蛋白质或携带疏水性的药物，通过油体结合蛋白也能成功地生产出具有生物活性的葡萄醛酸酶(GUS)、木聚糖酶和水蛭素等。此外，植物油体结合蛋白还可以通过与营养价值高的外源蛋白或多肽融合，改善种子的营养成分、提高种子食用及作为饲料的品质、在作物高产和基因工程安全性等方面发挥着作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种分离的DNA序列。本专利技术的再一的目的是，提供上述分离的DNA序列的用途。本专利技术的另一的目的是，提供一种表达重组载体。本专利技术的第四个目的是，提供上述重组表达载体的用途。本专利技术的第五个目的是，提供一种基因工程化的宿主细胞。本专利技术的第六个目的是，提供上述基因工程化的宿主细胞的用途。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是：一种分离的DNA序列，所述的DNA序列为：a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的DNA序列在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增加粮油作物的油脂产量中的应用。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种重组表达载体，所述的载体是由如上所述的核苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。优选的，所述的质粒是pYES2质粒。为实现上述第四个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的重组表达载体在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增加粮油作物的油脂产量中的应用。为实现上述第五个目的，本专利技术采取的技术方案是：一种基因工程化的宿主细胞，所述的宿主细胞选自于下列中的一种：a)用如上所述的核苷酸序列转化或转导的宿主细胞及其后代细胞；b)用如上所述的重组表达载体转化或转导的宿主细胞及其后代细胞。所述的宿主细胞是细菌细胞、真菌细胞，或这些宿主细胞的后代。优选的，所述的宿主细胞是酵母细胞。为实现上述第六个目的，本专利技术采取的技术方案是：如上所述的宿主细胞在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体的稳定性或增加粮油作物的油脂产量中的应用。本专利技术提供了缺刻缘绿藻油体钙蛋白(MiClo)基因序列并对其进行功能鉴定。该基因是特异性锚定于油体表面的结构蛋白，在粮油作物中过表达能增强油体的稳定性，因而能导致油体的过积累以增加油脂产量。本专利技术优点在于：1、本专利技术基于缺刻缘绿藻转录组高通量的测序数据，筛选出一条与已知油体钙蛋白基因有很高相似性的一条长810bp的片段。基于该片段序列设计引物并利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆到该基因的全长cDNA序列，通过同源比对确定该基因为油体钙蛋白基因家族，将此命名为MiClo，并进一步获得了MiClo的DNA全长序列。2、本专利技术通过在真核模式生物酵母BY4741菌株中与增强型黄色荧光蛋白(eYFP)融合表达该基因，即基因过表达实验，发现该基因编码蛋白确实定位在酵母细胞的油体上，从而证实了MiClo基因所编码的蛋白能准确地锚定于油体上，具有维持油体结构完整性的功能。附图说明附图1是缺刻缘绿藻MiClo的基因结构示意图，图中灰色线是非翻译区，黑色线为内含子，黑色框为外显子。附图2是酵母细胞的荧光图片，从上到下依次为酵母菌株BY4741，转携带eYFP载体pY-eYFP的BY4741菌株，转携带目的基因的eYFP融合表达载体pY-MiClo-eYFP的BY4741菌株。Bright为明场图，Yellow为eYFP发射的黄色荧光蛋白信号图，Red为Nile Red染色后发射的红色荧光信号图，Merged为前面三幅图的叠加图。附图3是pMD19T载体图谱。附图4是pYES2载体图谱。具体实施方式下面结合附图对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。本专利技术的技术路线是：1)在温度为25℃、光照强度为115μmol photons m-2s-1的条件下，于BG-11培养基中培养缺刻缘绿藻。收集藻细胞，并提取基因组DNA和RNA。2)自缺刻缘绿藻转录组测序数据中筛选得到一条与已知油体钙蛋白基因有很高相似性的长810bp的片段，基于该片段序列，利用RACE技术得到油体钙蛋白基因的cDNA序列全长，我们将其命名为MiClo。然后，利用缺刻缘绿藻RNA反转录的cDNA为模版对MiClo的cDNA全长序列进行该序列验证。3)根据MiClo全长的cDNA序列设计引物，利用缺刻缘绿藻DNA作为模版进行PCR扩增，得到MiClo的DNA全长序列。4)根据MiClo的cDNA全长序列以及eYFP(enhanced yellow fluorescent protein，增强型黄色荧光蛋白)的序列设计引物，利用PCR构建本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；或b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种分离的DNA序列，其特征在于，所述的DNA序列为：
a)SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所述的核苷酸序列；或
b)与a)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的DNA序列在编码油体钙蛋白、增强粮油作物中油体
的稳定性或增加粮油作物的油脂产量中的应用。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述的载体是由权利要求1所述的核
苷酸序列与质粒或病毒所构建的重组表达载体。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述的质粒是
pYES2质粒。
5.权利要求3或4所述的重组表达载体在编码油体钙蛋白、增强粮油作物
中油体的稳定...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙诤，李婷，周志刚，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海;31