作为抗纤维蛋白溶解剂的纤维蛋白溶酶原活化剂的突变体制造技术

本发明专利技术涉及抗纤维蛋白溶解组合物，包括携带取代tPA上的Ser为Ala的至少一个点突变的至少一种tPA突变体，所述突变体抑制tPA和uPA的至少一个的纤维蛋白溶解活性，所以可用于治疗与纤维蛋白溶解过程相关的紊乱，具体地凝血病、血小板减少症和出血。本发明专利技术还提供了方法以及本发明专利技术的突变体的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】作为抗纤维蛋白溶解剂的纤维蛋白溶酶原活化剂的突变体专利
本专利技术涉及治疗具有提高的出血倾向的状况。更具体地，本专利技术涉及用在治疗纤维蛋白溶解相关紊乱的抑制tPA和uPA的纤维蛋白溶解活性的纤维蛋白溶酶原活化剂突变体及其抗纤维蛋白溶解组合物。专利技术背景本文中通过作者以及另外地通过专利申请号/专利号引用各种出版物。这些出版物、专利和专利申请的公开内容通过引用特此全文并入。损伤(injury)是全世界死亡的主要原因。交通事故每年引起超过百万例死亡，是全球排第九的死亡原因，并预期在2020年前变成排第三的导致死亡和残疾的原因。此外，每年约160万的人死于人际、集体或自主的暴力的故意行为。超过90％的外伤(trauma)死亡出现在相对贫穷的国家。促进医院死亡的另外的因素为出血，认为是约三分之一的住院外伤死亡的原因，并构成由于多器官衰竭的死亡的影响因素。止血系统有助于保持严重的血管损伤后的循环，无论是源自外伤或外科手术。大的外科手术和外伤引起相似的止血反应，并且在两种情况下，严重的失血呈现对凝血系统的极端挑战。对外科手术及外伤的非期望的响应的一部分为刺激凝块的分解(纤维蛋白溶解)，其在一些情况下变得有害(高纤维蛋白溶解)。抗纤维蛋白溶解剂减小了具有对外科手术的正常和扩大的纤维蛋白溶解反应的患者中的失血，没有明显的增加手术后并发症的风险。氨甲环酸为氨基酸赖氨酸的合成的衍生物，通过封闭纤维蛋白溶酶原上赖氨酸的结合位点而抑制纤维蛋白溶解。经选择性外科手术的患者中氨甲环酸的随机实验的系统回顾鉴定了包括3836名参与者的53个研究。氨甲环酸减小了对输血需要的三分之一(KerK等，BMCEmergMed.,2012,12:3)。早期给药短期的氨甲环酸在具有显著的出血或具有这样的事件的风险的外伤患者中减小死亡、血管闭塞的事件以及输血频率(KerK.同上)。哺乳动物中的纤维蛋白溶解级联包括两种主要的组分，酶原纤维蛋白溶酶原和两个纤维蛋白溶酶原活化剂组织类型纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)。内源纤维蛋白溶解以纤维蛋白溶酶原结合到血栓的主要组分纤维蛋白开始，然后被tPA或uPA活化成蛋白水解活性酶纤维蛋白溶酶。新产生的纤维蛋白溶酶裂解纤维蛋白凝块成通常被肝脏吸收的可溶的纤维蛋白降解产物(SFDP)。tPA为由5个结构域组成的类胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶：纤连蛋白指结构域(fingerdomain)(F)、表皮生长因子结构域(EGF)、两个kringle结构域(K1和K2)和蛋白酶结构域(P)。除了结合到它的底物纤维蛋白溶酶原，tPA还结合纤维蛋白。tPA结合纤维蛋白主要由它的指结构域介导，并且K1的一些参与还介导其从循环快速清除(StewartR等，JBiolChem.(2000),275:10112–10120)。uPA表达为包括N末端片段(ATF，氨基酸1-135)和蛋白酶结构域(氨基酸136-411)的单链分子(scuPA)，还称为小分子量uPA(LMW-uPA)。氨基末端片段(ATF)自身包括2个独立的结构域，已知结合uPA受体的氨基末端生长因子类结构域(GFD；氨基酸1-43)和单个kringle(K；氨基酸47-135)(RabbaniSA等，JBiolChem.(1992),267(20):14151-6；BdeirK等，Blood.(2003),102(10):3600-8)。scuPA当由纤维蛋白溶酶转变为2-链分子(tcuPA)时表达纤维蛋白溶酶原活化剂活性(StumpDC等，JBiolChem.(1986),261(36):17120-6)，或者当结合到它的受体时作为单链分子(HigaziA等，JBiolChem.(1995),270(29):17375-80)。虽然在纤维蛋白溶酶原活化的过程中，tPA和uPA裂解纤维蛋白溶酶原中氨基酸Arg560和Val561之间的相同单肽键，但是这些纤维蛋白溶解的活性的机制完全不同。tPA的纤维蛋白溶解以tPA和纤维蛋白溶酶原共结合到纤维蛋白开始，导致两种物质在凝块表面非常高的局部浓度，以及然后比在纤维蛋白不存在下发生的提高由tPA活化纤维蛋白溶酶原的效率几个数量级(HoylaertsM等，JBiolChem.(1982),257:2912-2919)。虽然纤维蛋白的存在还可提高uPA对纤维蛋白溶酶原的活化，但与tPA相反，uPA不结合到纤维蛋白(CollenD等，JBiolChem.(1986),261:1259-1266.)。已经显示，纤维蛋白溶酶原结合到纤维蛋白引起纤维蛋白溶酶原的构象变化，提高对uPA的亲和力(LijnenHR等，JBiolChem.(1986),261(3):1253-8；CollenD.等，CritRevOncolHematol.(1986),4(3):249-301；CollenD.等，JBiolChem.(1978),253:5395-5401)。纤维蛋白溶酶原活化剂的抑制剂可用于任何外伤后状况，无论其影响头、胸腹部或身体的其它部分。它们还可用在产后出血，或在可引起出血的任何手术期间。另外的使用可在出血性卒中、蛛网膜下出血或具有增加的出血倾向的其它的状况，例如血友病或弥散性血管内凝血(DIC)患者以及作为生物胶(biologicalglue)。专利技术概述根据第一方面，本专利技术涉及抗纤维蛋白溶解组合物，包括携带在如SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变的至少一种tPA(组织纤维蛋白溶酶原活化剂)突变体。更具体地，用于本专利技术的组合物的突变体抑制tPA和uPA(尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂)的至少一种的纤维蛋白溶解活性。在某些实施方式中，本专利技术的组合物可包括本专利技术提供的tPA突变体，所述tPA突变体携带在如SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变，以及可为下述的任一种的至少一个另外的突变：(a)SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置299-302中取代KHRR299-302为AAAA的至少一个点突变；(b)SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置120和106中取代N120为Q以及取代T106为N的至少一个点突变；以及(c)指和K1结构域的至少一种的缺失，如由SEQIDNO.4表示的。根据其一个方面，本专利技术提供了用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防的方法中的本专利技术描述的组合物。在另一个方面，本专利技术提供了分离的tPA突变的分子、或其任何片段或功能衍生物。更具体地，本专利技术提供的tPA突变体携带在如SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变，以及可为下述的任一种的至少一个另外的突变：(a)SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置299-302中取代KHRR299-302为AAAA的点突变；(b)SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置120和106中取代N120为Q以及取代T106为N的点突变；以及(c)指和K1结构域的至少一种的缺失，如由SEQIDNO.4表示的。在另一个方面，本专利技术涉及用于在需要其的受试者中治疗、改善、抑制或预防与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗纤维蛋白溶解组合物，所述抗纤维蛋白溶解组合物包括携带在如SEQ ID NO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变的至少一种tPA(组织纤维蛋白溶酶原活化剂)突变体，所述突变体抑制TPA和uPA(尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂)的至少一种的纤维蛋白溶解活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.07.05 US 61/668,1721.至少一种组织纤维蛋白溶酶原活化剂(tPA)突变体在制备用于在需要其的受试者中抑制tPA和尿激酶纤维蛋白溶酶原活化剂(uPA)的纤维蛋白溶解活性的抗纤维蛋白溶解组合物中的用途，所述tPA突变体携带在SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变，所述tPA突变体抑制tPA和uPA的纤维蛋白溶解活性，其中所述受试者患有与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况，其中所述疾病、紊乱或状况不是脑损伤和神经损伤，并且其中所述tPA突变体为以下的任一种：(a)称为tPASer481Ala的由SEQIDNO.1表示的氨基酸序列或SEQIDNO.1的衍生物组成的tPA突变体，所述SEQIDNO.1的衍生物由SEQIDNO.12表示的氨基酸序列组成；和(b)携带Ser481Ala和KHRR299-302至AAAA的点突变并称为tPASer481Ala-DS的tPA突变体，所述tPA突变体由SEQIDNO.2表示的氨基酸序列或SEQIDNO.2的衍生物组成，所述SEQIDNO.2的衍生物由SEQIDNO.13表示的氨基酸序列组成。2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述tPA突变体称为tPASer481Ala，并由SEQIDNO.1表示的氨基酸序列或SEQIDNO.1的衍生物组成，所述SEQIDNO.1的衍生物由SEQIDNO.12表示的氨基酸序列组成。3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述tPA突变体称为tPASer481Ala-DS，并由SEQIDNO.2表示的氨基酸序列或SEQIDNO.2的衍生物组成，所述SEQIDNO.2的衍生物由SEQIDNO.13表示的氨基酸序列组成。4.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为凝血病。5.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为血小板减少症。6.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为出血。7.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为不可压迫的出血。8.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为外伤引起的出血。9.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为妇科出血。10.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为小手术或大手术出血。11.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为先天凝血病。12.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为弥散性血管内凝血(DIC)。13.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为产后出血。14.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为血友病。15.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为出血损伤。16.根据权利要求1至3的任一项所述的用途，其中所述组合物用于与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的治疗、改善、抑制或预防，所述疾病、紊乱或状况为凝血相关的紊乱。17.治疗有效量的至少一种tPA突变的分子在制备用于在需要其的受试者中治疗、改善、抑制或预防与纤维蛋白溶解相关的疾病、紊乱或状况的组合物中的用途，其中所述疾病、紊乱或状况不是脑损伤和神经损伤，且其中，所述tPA突变的分子携带在SEQIDNO.7表示的野生型分子的位置481中取代Ser481为Ala的点突变，所述tPA突变的分子为以下的任一种：(a)称为tPASer481Ala的由SEQIDNO.1表示的氨基酸序列或SEQIDNO.1的衍生物组成的tPA突变体，所述SEQIDNO.1的衍生物由SEQIDNO.12表示的氨基酸序列组成；和(b)携带Ser481Ala和KHRR299-302至AAAA的点突变并称为tPASer481Ala-DS的tPA突变体，所述tPA突变体由SEQIDNO.2表示的氨基酸序列或SEQIDNO.2的衍生物组成，所述SEQIDNO.2的衍生物由SEQIDNO.13表示的氨基...

【专利技术属性】
技术研发人员：阿卜得·希贾兹，努哈·希扎基，
申请(专利权)人：哈达斯特医疗研究服务和开发有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL