道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法技术

本发明专利技术公开了一株道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16，于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9676。本发明专利技术详细描述了道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16的形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列测定结果等。经固氮试验表明，本发明专利技术道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16的发酵液对道地黄芪有较好的固氮作用，可以有效地为道地黄芪生长提供天然氮源需要，从而对道地黄芪的天然品质提供相应的营养来源。

【技术实现步骤摘要】
道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法
本专利技术涉及植物固氮细菌的利用领域，具体地说是涉及一种道地中药黄芪固氮菌t16及发酵液的制备方法。
技术介绍
近年来，全球种植业过分依赖和大量施用化肥造成的肥料浪费、土壤和地下水污染以及生态失衡已经引起了世界各国的广泛关注。减少化肥的使用、提高氮肥利用率是当前农业生产中急需解决的重要问题。充分发挥固氮细菌的生物固氮作用是减少氮肥使用量最有效的途径，生物固氮资源的研究、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。生物固氮是自然界中仅次于光合作用的复杂生物反应系统，为全球的植物提供了大约75%的氮素。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用。固氮细菌根据其生活习性可分为自身固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌三类。自身固氮菌是指在自由生活状态下能够固氮的细菌，其种类不多，分布很广，如圆褐固氮菌和拜叶林克氏固氮菌。联合固氮菌是指定植于植物根表和近根土壤中，有的能侵入表皮和外皮层的细胞间隙，靠根系分泌物生存、繁衍，与植物根系有密切的关系的固氮细菌，如雀稗固氮菌和产脂固氮螺菌。共生固氮菌的细菌只有根瘤菌一类，其广泛存在于土壤中，浸染豆科植物根部形成根瘤，能将空气中的氮气转化为氨提供给植物。上述三类固氮菌中，自身固氮菌由于其固氮效率低，且固氮特殊，不适合在农业方面广泛应用，所以目前农业方面主要应用联合固氮菌和共生固氮菌。黄芪（AstragalusmembranaceusBunge）是豆科黄芪属多年生草本植物，又名绵芪。在我国产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用，作为药用已有2000多年的历史。由于长期大量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险。在黄芪种植过程中，各项农资投入中化肥尤其是氮肥所占比重很大，其对黄芪的产量和活性成分聚集的影响也最显著。而黄芪作为豆科植物，其根际土壤中也共生有大量固氮菌，发挥着重要的固氮作用。山西浑源县是中药材黄芪的产地。得益于当地水土，浑源所产黄芪甲甙、多糖等含量均为国内之首，并于2011年获批国家地理标志证明商标“正北芪”。根据浑源道地黄芪的正宗药用性和原产地有用成份这一地理标识产物，以其原生地土壤根瘤菌为研究基础，对道地黄芪的固氮根瘤菌进行分离，筛选和鉴定，并对其培养条件和生理生化以及生物信息学方面进行研究。该研究为利用生物固氮在黄芪生产上实现节肥减耗、加强黄芪种植业生态系统的良性循环提供科学基础和技术支持。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一株道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法，该发酵液具有非常明显的固氮活性。本专利技术的目的是通过如下技术方案实现的。一株道地黄芪固氮菌（Rhizobiumsp.）新菌株t16于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9676，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。所述的道地黄芪固氮菌（Rhizobiumsp.）新菌株t16是从山西省浑源地区的黄芪生长土壤为材料分离得到的根瘤细菌。将道地黄芪固氮菌在Ashby无氮培养基上，新菌株t16的菌落在YMA平板上呈圆形，白色，半透明，湿润（见图1）。革兰氏染色，显示新菌株t16为革兰氏阴性杆菌（见图2），孔雀绿染色呈阴性，提示新菌株t16细胞内不含有芽胞（见图3）。根据《常见细菌系统鉴定手册》对新菌株t16进行了生理生化鉴定，结果见表1。表1本专利技术新菌株t16的生理生化特征注：“＋”表示呈阳性反应；“－”表示呈阴性反应.提取黄芪固氮菌新菌株t16的基因组DNA，利用PCR反应扩增其16SrRNA部分序列，得到一条约为1500bp左右的DNA片段（图4）。测序后获得序列长度为1309bp（见表2），测序结果使用BLAST软件在GeneBank数据库中进行同源性比对，结果显示，新菌株t16与Rhizobiumfabae的16SrRNA基因序列同源性为100%（KF465964.1），结合形态观察及生理生化试验，将新菌株t16确定为根瘤菌(Rhizobiumsp.)。表2本专利技术新菌株t16的16S测序结果道地黄芪固氮菌新菌株t16发酵液的制备方法，包括如下步骤：(1)种子液制备从试管斜面上用接种针挑取新菌株t16到斜面培养基（由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养斜面）上，恒温28℃培养24h后接种到装有100mL的LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得种子液；(2)发酵液制备将(1)制备的种子液按体积比1%的比例接入发酵培养基，培养条件是：28℃、初始pH为6.8～7.0、摇床转速180－200r/min震荡培养30h，制得发酵液。所述的发酵培养基是由下列质量体积比的成分组成：甘露醇14份，酵母粉5份，MgSO4·7H2O0.1份,K2HPO40.3-0.4份,NaCl0.3-0.4份，CaCl20.01份，H2O1000份，所配得的培养基pH6.8～7.0。采用上述步骤制备的道地黄芪固氮新菌株t16的发酵液进行固氮效果试验1.试验方法供试黄芪种子由山西浑源县黄芪种植基地提供。采用全N差值法来测定菌株的固氮能力。将道地黄芪固氮新菌株t16接种到100mlYMA液体培养基中，28℃摇瓶培养后，用血球计数板计数，用去离子水稀释，获得含菌量为106ml-1、107ml-1、108ml-1的菌剂。将洗净灭菌的蛭石(粒径为2mm)放入直径8cm、高10cm塑料盆中，作为无氮培养场地。试验分3个处理和1个对照共四组，每组5个样品盆，重复三次，随机排列。各处理组的黄芪种子用上述三个浓度的菌液浸泡3h，对照用去离子水浸泡3h。然后将种子播种到装有蛭石的塑料盆中，并把上述菌剂各30ml倒入到相应的盆中，在山西农业大学生科院实验室内进行培养。每天浇水30ml，培养30天收获黄芪苗，每组随机采样100株幼苗全株，计量平均苗高和叶片数，洗净后置于烤箱内烘干，测定黄芪苗的含氮量(鲍士旦，2000)。2.试验结果(1)黄芪苗高及叶片数试验结果见表3。表3本专利技术新菌株t16发酵液处理黄芪种子后对黄芪苗的影响组别Ck106107108平均苗高(cm)11.8±1.8313.9±0.83**13.3±0.9*13.1±1.04*平均叶数(片/株)5.7±1.427.2±0.87**6.2±1.96.9±1.51*注：*跟Ck相比较P<0.05**跟Ck相比较P<0.01试验结果表明，用本专利技术的黄芪固氮新菌株t16的发酵液处理黄芪种子后，对黄芪幼苗生长速度和叶片发育速度均有显著的促进作用，培养30d后黄芪的苗高和叶片数均显著高于对照（见图5-8），其中含菌量在106ml-1这一浓度处理后的效果要优于另外两个较高浓度的效果。这也提示，在用菌液处理种子时，不是浓度越大越好，适当的浓度效果可能更佳。(2)黄芪苗含氮量试验结果见表4。表4本专利技术新菌株t16发酵液处理黄芪种子后对黄芪苗的含氮量的影响（mg/株）组别Ck106107108含氮量57.34±0.423468.04±0.6986**65.5±1.6381**66.65±1.1334**注：**跟Ck相比较P<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株道地黄芪固氮菌（Rhizobium sp.）新菌株t16于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9676。

【技术特征摘要】
1.一种道地黄芪固氮菌新菌株t16，其特征在于，所述菌株为根瘤菌（Rhizobiumsp.），于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9676。2.权利要求1所述的道地黄芪固氮菌新菌株t16发酵液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：(1)种子液制备从试管斜面上用接种针挑取新菌株t16到斜面培养基，由YMA液体培养基添加1.5%琼脂制成培养斜面，恒温28℃培养24h后接种到装有100mL的LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得种子液；(...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐中伟，梁建萍，周然，薛智权，李浩，李倩，
申请(专利权)人：山西农业大学，山西中医学院，
类型：发明
国别省市：山西;14