类人胸腺肽α1基因序列、类人胸腺肽α1及其制备方法技术

本发明专利技术属于基因工程制药技术领域，具体涉及一种类人胸腺肽α1基因序列、类人胸腺肽α1及其制备方法。该肽氨基酸序列为，SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEQ。该肽的制备方法包括引物设计、PCR扩增、酶切、自连接、构建重组质粒表达载体、转化、筛选、重组质粒载体的改造、再转化、诱导表达、串联体类人胸腺肽α1的纯化、切割获得类人胸腺肽α1蛋白单体等步骤。本发明专利技术所提供的类人胸腺肽α1单体与人胸腺肽α1结构类似，生物学功能相同，可以替代人胸腺肽α1的使用。同时本发明专利技术所提供的类人胸腺肽α1的制备方法，具有产量高、纯度高、制备方法简便快捷等优点，适于推广应用。

【技术实现步骤摘要】
类人胸腺肽α1基因序列、类人胸腺肽α1及其制备方法
本专利技术属于基因工程制药
，具体涉及一种类人胸腺肽α1基因序列、类人胸腺肽α1及其制备方法。
技术介绍
胸腺肽α1最早是由Goldstein等从牛胸腺素组分5（TF5）中分离出来的，是一种胸腺内分泌细胞与胸腺上皮细胞产生的一种高度保守的活性肽。在体内胸腺肽α1是由α1-胸腺肽原(prothymosine)经酶解加工而成，成熟的胸腺肽α1含有28个氨基酸，其氨基酸序列为：Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu--Glu-Ala--Glu-Asn，分子量为3.108KD，等电点为4.2。胸腺肽α1在人体血清中的正常浓度大约为540~670pg/mL，其主要生理功能为调节人体免疫机能，包括刺激多能干细胞分化为胸腺细胞，促进T-细胞的分化和成熟，增强T细胞的功能，并使CD3+和CD4+等细胞的数量升高等。胸腺肽α1作为一种广谱的免疫调节剂，临床结果已显示其对乙型肝炎和丙型肝炎有显著的疗效，对肿瘤和艾滋病也有一定疗效。此外胸腺肽α1还可用于疫苗的辅助药剂，以增强免疫机能底下的患者对疫苗的应答能力。现有技术中，胸腺肽α1的制备大多是从动物胸腺中提取，但是由于提取物为混合物，有效成分浓度低，疗效不够理想，而且混合物中含动物蛋白，注射时可能引起过敏反应。也有采用化学方法合成来制备胸腺肽α1的，但其主要问题是成本高昂，难以推广应用。例如药品名为“日达仙”的胸腺肽a1制品，每只含量仅1.6mg，而价格却高达700元以上，一个疗程就需要5万多元，这让普通病人难以承受，而且化学药品制备过程中难免会出现污染问题，因而限制了该技术的推广应用。近年来也有研究人员试图通过基因工程的方法来制备胸腺肽α1，通过基因工程的应用，虽然在体外成功表达了胸腺肽α1，但制备过程中所获得的重组蛋白需要经过亲和层析、离子交换层析、酶切等步骤，而且产量低，纯化困难，并不适合批量化、工业化生产，因而有必要继续探索并改进。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种类人胸腺肽α1基因序列、类人胸腺肽α1及其制备方法；类人胸腺肽α1基因序列所编码翻译的类人胸腺肽α1具有与人胸腺肽α1相同的功能；所提供的类人胸腺肽α1的制备方法可以在短时间内较为简捷、快速地获得大量的类人胸腺肽α1，从而替代人胸腺肽α1的使用，降低其使用成本。本专利技术所采取的技术方案如下。类人胸腺肽α1的基因序列，其序列如序列表中序列1所示，具体为：5’-CTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTTTCTTTTCTTTTAAGTCTTTCGTAGTTATTTCACTGCTGGTATCGACCGCAGCATCCGA-3’。类人胸腺肽α1基因序列所编码的类人胸腺肽α1，该肽包括28个氨基酸，其氨基酸序列如序列表序列2所示，具体为：SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEQ。类人胸腺肽α1在医药领域的应用可以替代现有的人胸腺肽α1。所述类人胸腺肽α1的制备方法，包括以下步骤：（1）以编码类人胸腺肽α1的基因序列为模板，设计引物，PCR扩增；以编码类人胸腺肽α1的基因序列为模板进行PCR扩增，首先进行引物设计，引物设计目的在于在基因的C端加上限制性内切酶BslI酶切位点，N端加上限制性内切酶AlwnI酶切位点，引物序列设计如下：上游引物5’-ATACCTAATGTCGGATGCTGCGGTCGATACCAGC-3’；下游引物5’-ATACAGCATCTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTT-3’；PCR扩增体系：类人胸腺肽α1基因，0.1μL；上游引物，100μM0.5μL；下游引物，100μM0.5μL；PCR扩增Mix，12.5μL；三蒸水，11.4μL。PCR扩增程序：预变性95℃5min，95℃30s、60℃30s、72℃30s，30个循环，72℃10min。（2）对步骤（1）中PCR扩增的类人胸腺肽α1基因序列进行酶切、自连接，构建含有类人胸腺肽α1基因序列不同拷贝数目的重组质粒表达载体；具体如下：①目的基因的酶切、自连接将步骤（1）中PCR产物在37℃条件下先用酶AlwnI切割4h，酶切体系为：酶AlwnI，10000U/mL0.5μL，CutSmartBuffer(随酶提供)，2μL；步骤（1）中PCR产物，10μL；三蒸水，7.5μL。酶切完成后将温度逐渐升高到55℃，再在原有体系中加入0.5μL酶BslI（20000U/mL）切割1h。胶回收双酶切后目的基因备用，所述目的基因即类人胸腺肽α1基因。用T4DNA连接酶连接目的基因使其头尾相连，连接体系为：10XT4DNA连接酶反应缓冲液，2μL；T4DNA连接酶，350U/μL1μL；胶回收后的目的基因片段，0.1μg/mL17μL；连接温度为4℃，时间为24h。②自连的目的基因与质粒载体Pet-31b（+）连接构建含有类人胸腺肽α1基因序列不同拷贝数目的重组质粒载体（由于目的基因自连时，自连接数目的不确定性，一般会有2~6个数目的目的基因的自连，因而是可以构建含有不同拷贝数目的重组质粒表达载体的）；酶AlwnI酶切质粒载体Pet-31b(+)，酶切体系为：酶AlwnI，10000U/mL0.5μL；CutSmartBuffer(随酶提供)，2μL；质粒载体Pet-31b(+)，0.2μg/μL6μL；三蒸水，11.5μL；切割时间为4h，温度为37℃。酶切后质粒载体Pet-31b(+)用碱性磷酸酶CIAP处理防止载体自连，处理体系为：酶切后载体，17μL；碱性磷酸酶CIAP，10~30U/μL1μL；10×碱性磷酸酶缓冲液，2μL。将碱性磷酸酶处理后质粒载体与步骤①中自连后的目的基因用T4DNA连接酶16℃连接过夜，连接体系为：步骤①中自连后目的基因，9μL；碱性磷酸酶处理后的质粒载体，8μL；10XT4DNA连接酶反应缓冲液，2μL；T4DNA连接酶，350U/μL1μL。（3）转化、筛选；将步骤（2）所构建的携带有不同拷贝数目的类人胸腺肽α1基因质粒载体转化，筛选并测序鉴定；将步骤（2）连接好的携带有不同拷贝数目（一般而言为2~6个拷贝数目，优选4个拷贝数目）的类人胸腺肽α1基因质粒载体连接体系，加入到100μLJM109感受态细胞（细胞浓度大约5×107个/mL）中，迅速置冰上30min，42℃热激90s，迅速放于冰上2min，涂于含100µg/mL氨苄青霉素LB平板上，37℃培养过夜。菌落PCR鉴定，并测序鉴定。（4）重组质粒载体的改造；对步骤（3）中筛选测序正确的重组质粒载体进行改造以去除会使目的蛋白形成包涵体的KSI（ketosteroidisomerase）。以步骤（3）所获得的含4个拷贝数目的目的基因的重组质粒载体为例，改造步骤如下：①PCR扩增含有4个拷贝数目的目的基因的重组质粒载体设计引物：上游引物5’–AAAGGATCCGAGAAGAATATTCACGCATGCCATATGTC-3’，下游引物5’-AAAGTCGACGGCTTTGTTAGCAGCCGGATCTC-3’。PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
类人胸腺肽α1的基因序列，其特征在于，该序列如序列表序列1所示，即：5’‑CTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTTTCTTTTCTTTTAAGTCTTTCGTAGTTATTTCACTGCTGGTATCGACCGCAGCATCCGA ‑3’。

【技术特征摘要】
1.类人胸腺肽α1的基因序列，其特征在于，该序列如序列表序列1所示，即：5’-CTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTTTCTTTTCTTTTAAGTCTTTCGTAGTTATTTCACTGCTGGTATCGACCGCAGCATCCGA-3’。2.权利要求1所述类人胸腺肽α1基因序列所编码的类人胸腺肽α1，其特征在于，该肽包括28个氨基酸，其氨基酸序列如序列表序列2所示，即：SDAAVDTSSEITTKDLKEKKEVVEEAEQ。3.权利要求2所述类人胸腺肽α1的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：（1）以编码类人胸腺肽α1的基因序列为模板，设计引物，PCR扩增；引物序列设计如下：上游引物5’-ATACCTAATGTCGGATGCTGCGGTCGATACCAGC-3’；下游引物5’-ATACAGCATCTGCTCGGCTTCTTCCACAACCTCTT-3’；（2）对步骤（1）中PCR扩增后的类人胸腺肽α1基因序列进行酶切、自连接，构建含有类人胸腺肽α1基因序列不同拷贝数目的重组质粒载体；（3）转化、筛选；将步骤（2）所构建的携带...

【专利技术属性】
技术研发人员：翁海波，张冲，李倩，安秀丽，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41