本发明专利技术公开了一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其在微生物转化制备羟化环氧黄体酮中的应用，以枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含菌发酵液为酶源，以环氧黄体酮为底物，同时获得了三种羟基化环氧黄体酮：11α-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，6β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，7β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，具有一步引入、专一性强、环境污染小的优点，且操作简单，分离迅速，便于大规模生产应用，在工业生产性激素和其他甾体激素药物的方面，具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
枝孢霉ZF-35及在制备羟化环氧黄体酮中的应用(一)
本专利技术涉及一株新的海洋真菌，特别涉及一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其对环氧黄体酮进行生物转化从而获得羟化环氧黄体酮的应用。(二)
技术介绍
生物转化是在细胞或酶等生物催化剂催化下进行某种化学修饰的化学反应，广泛应用于天然产物的生物合成、药物前体化合物的转化、有机化合物的不对称合成、药物代谢研究等领域，在结构复杂的天然产物的结构修饰中显示了巨大的应用潜力。A.ChristyHunter等利用曲霉属真菌tamariiKITA对一系列的5-enesteroids进行了生物转化的研究，确证了5-enesteroids的代谢途径涉及了内酯化酶和羟基化酶的共同作用，首次证明了真菌具有同时调控dehydroepiansdrosterone以及含有c-17侧链的甾体类化合物的作用。KunChen，Wang-YuTong等利用犁头霉属coeruleaIBL02实现了16α，17α-epoxyprogesterone的C11-β羟基化。近20年间，随着陆生资源的急剧减少，人类面临着可持续发展与资源匮乏的矛盾，从而使开发海洋资源成为不可抗拒的热潮。海洋微生物的多样性加之生长环境的特殊性，决定了其独特的多元结构是陆生植物无法比拟的，其新颖性和复杂性是科学家无法预测的，因此海洋真菌内新颖的代谢体系，或许能作为环氧黄体酮转化的新体系，从而成为新药研制开发的基础。本专利技术以海洋真菌为研究对象，以环氧黄体酮为底物，研究了海洋真菌对环氧黄体酮的转化工艺。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其微生物转化制备羟化环氧黄体酮的方法，该方法通过枝孢霉转化获得了多种羟化产物，解决了化学合成羟化环氧黄体酮困难，污染严重的问题。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一株新菌株--枝孢霉(Cladosporiumsphaerospermum)ZF-35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M2014399，保藏日期2014年9月5日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。本专利技术还提供了一种所述枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，所述的应用为：以16α,17α-环氧黄体酮为底物，以无水乙醇为反应介质，以枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含菌发酵液为酶源，在25～30℃、160～200rpm下进行转化反应，转化反应结束后(优选反应2-3天)，将转化反应液分离纯化，获得羟化环氧黄体酮；所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0.25～0.8g/mL反应介质，所述16α,17α-环氧黄体酮用量为0.1～0.3g/mL反应介质。本专利技术所述应用中底物先与反应介质混合后，再加入酶源中进行转化反应。进一步，优选所述酶源按如下步骤制备：(1)种子培养将接种环灭菌，无菌操作挑取保藏于液体石蜡的斜面中的枝孢霉ZF-35真菌孢子，用划线法接入新制备含种子培养基的培养皿中；将培养皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养2天后，出现明显的单菌落，继续培养约3～4d，出现分生孢子，获得种子菌落；种子培养基终浓度组成：葡萄糖5～15g/L，酵母浸粉1～1.5g/L，蛋白胨1.5～2.5g/L，琼脂15～20g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～6；优选种子培养基组成为：葡萄糖7～12g/L，酵母浸粉1.1～1.3g/L，蛋白胨1.7～2.2g/L，琼脂17～21g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～5；人工海水终浓度组成:NaCl24.477g/L、MgCl2·6H2O4.9810g/L、Na2SO43.9170g/L、CaCl2·H2O1.1020g/L、KCl0.6640g/L、NaHCO30.1920g/L、KBr0.0960g/L、H3BO30.0260g/L、SrCl20.0240g/L、NaF0.0039g/L，溶剂为蒸馏水；(2)发酵培养用接种环挑取种子菌落接种于发酵培养基中，放入25～30℃恒温培养箱中培养3～4天至菌体湿重为30～60g/L发酵液，获得含菌发酵液；发酵培养基终浓度组成：葡萄糖25～35g/L，玉米浆20～30g/L，硫酸铵1.5～2g/L，酵母粉0.5～1g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～6；优选发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖27～30g/L，玉米浆22～27g/L，硫酸铵1.7～1.9g/L，酵母粉0.6～0.9g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～5；所述人工海水的组成同种子培养基；所述人工海水的组成同种子培养基。进一步，优选所述反应液分离纯化的方法为：转化反应结束后，将反应液过滤，滤液用乙酸乙酯萃取，将乙酸乙酯层减压蒸馏获得产物浸膏，再将产物浸膏进行硅胶柱层析，分别以体积比1:4的乙酸乙酯和石油醚混合液，体积比1：3的乙酸乙酯和石油醚混合液、体积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液、体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液、无水乙酸乙酯为洗脱液进行梯度洗脱，收集洗脱剂为体积比1:2的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流出液，得到转化产物1；收集体积比1:1的乙酸乙酯和石油醚混合液对应的流出液，得到转化产物2；收集无水乙酸乙酯对应的流出液，得到转化产物3，分别干燥，获得三种羟化环氧黄体酮。更进一步，优选所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0.25～0.6g/mL反应介质，所述16α,17α-环氧黄体酮用量为0.1～0.2g/mL反应介质。本专利技术采用从东海海水中分离获得的具有环氧黄体酮羟基化能力海洋真菌，通过将接种环灭菌，无菌操作挑取保藏于液体石蜡的斜面中的真菌孢子，用划线法接入新制备种子培养基中；将培养皿倒置于28℃的恒温培养箱中培养，密切观察其生长状况并记录；培养约2天后，即出现明显的单菌落，继续培养约3～4d，出现分生孢子，用接种环挑取其中没有污染且生长较好的菌落接种于经过优化的发酵培养基中，放入28℃恒温培养箱中培养；培养4d后，将底物溶于2％(占发酵液体积)无水乙醇中，投入到转化瓶中，转化48h后取出，乙酸乙酯萃取，取乙酸乙酯层，减压蒸馏得浸膏，5mL乙酸乙酯溶解，加入适量粗硅胶至糊状，减压浓缩至干，进行硅胶柱层析，收集含目标组分的流出液，HPLC确定组分纯度，核磁分析检测，最终确定化合物结构。与现有技术相比，本专利技术的有益效果主要体现在：本专利技术提供一株新菌株--枝孢霉ZF-35及其生物转化环氧黄体酮制备羟化环氧黄体酮的方法，即利用微生物转化的方法，以枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含菌发酵液为酶源，以环氧黄体酮为底物，同时获得了三种羟基化环氧黄体酮：11α-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，6β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，7β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮，具有一步引入、专一性强、环境污染小的优点，且操作简单，分离迅速，便于大规模生产应用；羟化环氧黄体酮可作为甾体激素类药物化学合成的先导化合物，对于研究其新化学合成路径具有重要的指示作用。由于该微生物转化方法具有作用条件温和，可以在常温、弱酸性、水等环境中进行，同时具有高效本文档来自技高网...
【技术保护点】
枝孢霉(Cladosporium sphaerospermum)ZF‑35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M 2014399，保藏日期2014年9月5日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。
【技术特征摘要】
1.球孢枝孢霉(Cladosporiumsphaerospermum)ZF-35，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNo：M2014399，保藏日期2014年9月5日，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编430072。2.一种权利要求1所述球孢枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述的应用为：以16α,17α-环氧黄体酮为底物，以无水乙醇为反应介质，以球孢枝孢霉ZF-35经发酵培养获得的含菌发酵液为酶源，在25～30℃、160～200rpm下进行转化反应，转化反应结束后，将转化反应液分离纯化，分别获得11α-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮、6β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮和7β-羟基-16α,17α-环氧-孕甾-4-烯-3,20-二酮；所述酶源的用量以含菌发酵液中湿菌体的重量计为0.25～0.8g/mL反应介质，所述16α,17α-环氧黄体酮用量为0.1～0.3g/mL反应介质。3.如权利要求2所述球孢枝孢霉ZF-35在制备羟化环氧黄体酮中的应用，其特征在于所述酶源按如下步骤制备：(1)种子培养将球孢枝孢霉ZF-35接种至种子培养基中，于28℃的恒温培养箱中培养至出现分生孢子，获得种子菌落；种子培养基终浓度组成：葡萄糖5～15g/L，酵母浸粉1～1.5g/L，蛋白胨1.5～2.5g/L，琼脂15～20g/L，以体积比6:4的人工海水与蒸馏水的混合液为溶剂，pH为4～6；人工海水终浓度组成:NaCl24.477g/L、MgCl2·6H2O4.9810g/L、Na2SO43.9170g/L、CaCl2·H2O1.1020g/L、KCl0.6640g/L、NaHCO30.1920g/L、KBr0.0960g/L、H3BO30.0260g/L、SrCl20.0240g/L、NaF0.0039g/L，溶剂为蒸馏水；(2)发酵培养用接种环挑取种子菌落接种于发酵培养基中，放入25～30℃恒温培养箱中，160～200rpm培养至湿菌体含量达到30～60g/L，获得含菌发酵液；发酵培养基终浓度组成：葡萄糖25～35...
【专利技术属性】
技术研发人员：王鸿，周峰，陈苏，沈青青，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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