一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA及其应用。该干扰MCM7基因的小分子RNA为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的碱基序列。本发明专利技术设计对胶质瘤增殖有促进作用的干扰MCM7基因的小分子RNA，应用胶质瘤细胞(U373细胞)模型研究其对胶质瘤增殖的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新分子药物。

【技术实现步骤摘要】
一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种小分子干扰RNA(即shRNA)，尤其涉及一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA；另外，本专利技术还涉及该干扰MCM7基因的小分子RNA的制备方法和应用。
技术介绍
MCM7蛋白是MCM(minichromosomemaintenance)复合物的组成成分之一，具有DNA解旋酶活性，参与DNA复制起始，对细胞增殖、DNA损伤修复和细胞周期起重要的调控作用，有研究显示，MCM7在多种肿瘤中高表达(包括脑胶质瘤)，可以作为多种恶性肿瘤的诊断和预后指标。胶质瘤是发生于神经外胚层的肿瘤，故亦称神经外胚层肿瘤或神经上皮肿瘤。肿瘤起源于神经间质细胞，即神经胶质、室管膜、脉络丛上皮和神经实质细胞，即神经元。大多数肿瘤起源于不同类型的神经胶质，但根据组织发生学来源及生物学特征类似，对发生于神经外胚层的各种复查肿瘤病，一般都称为神经胶质瘤。胶质瘤的分类方法很多，临床工作者往往采用的是分类比较简单的Kernohan分类法。各型胶质瘤中，以星形细胞瘤最多，其次为胶质母细胞瘤，其后依次为髓母细胞瘤、室管膜瘤、少枝胶质瘤、松果体瘤、混合性胶质瘤、脉络丛乳头状瘤、未分类胶质瘤及神经元性肿瘤。各型胶质瘤的好发部位不同，如星形细胞瘤成人多见于大脑半球，儿童则多发在小脑；胶质母细胞瘤几乎均发生于大脑半球；髓母细胞瘤发生于小脑蚓部；室管膜瘤多见于第4脑室；少枝胶质瘤大多发生于大脑半球。胶质瘤以男性较多见，特别在多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤，男性明显多于女性。各型胶质母细胞瘤多见于中年，室管膜瘤多见于儿童及青年，髓母细胞瘤几乎都发生在儿童。胶质瘤的部位与年龄也有一定关系，如大脑星形细胞瘤和胶质母细胞瘤多见于成人，小脑胶质瘤(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤)多见于儿童。胶质瘤大多缓慢发病，自出现症状至就诊时间一般为数周至数月，少数可达数年。恶性程度高的和后颅窝肿瘤病史较短，较良性的或位于静区的肿瘤病史较长。肿瘤若有出血或囊变，症状会突然加重，甚至有类似脑血管病的发病过程。胶质瘤的临床症状可分两方面，一是颅内压增高症状，如头痛、呕吐、视力减退、复视、精神症状等；另一是肿瘤压迫、浸润、破坏脑组织所产生的局灶症状，早期可表现为刺激症状如局限性癫痫，后期表现为神经功能缺失症状如瘫痪。胶质瘤的诊断，根据其生物学特征、年龄、性别、好发部位及临床过程进行分析，在病史及体征基础上，采用电生理、超声波、放射性核素、放射学及核磁共振等辅助检查，定位正确率几乎是100％，定性诊断正确率可在90％以上。RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。RNA干扰(RNAi)的基本原理是利用具有同源性的双链RNA(dsRNA)迅速阻断序列特异的目标基因的表达活性，是实验室中一种有效的阻断基因表达的工具。目前，尚未见有关用于抑制胶质瘤增殖的MCM7基因的相同序列小分子干扰RNA的报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA。本专利技术要解决的技术问题之二是提供该干扰MCM7基因的小分子RNA的制备方法。本专利技术要解决的技术问题之三是提供该干扰MCM7基因的小分子RNA的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：在本专利技术的一方面，提供一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA，其对应的序列为：正义链:5′-CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCG-3′，如SEQIDNO.1所示；反义链:5′-GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCT-3′，如SEQIDNO.2所示。所述RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA(大约21～23bp)，即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。在本专利技术的另一方面，提供一种制备上述用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA的方法，该方法的具体步骤为：步骤一、根据PMT98载体设计的具体要求，设计对应于MCM7基因第1974-1994位，即:GCATTGATGAGTTCGACAAGA的shRNA寡核苷酸序列并进行合成，所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为：如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的碱基序列；步骤二、依据PMT98载体设计的要求，将设计的shRNA序列和PMT98质粒进行连接，得到用于抑制胶质瘤增殖的MCM7基因的一种小分子干扰RNA。在本专利技术的另一方面，提供一种上述干扰MCM7基因的小分子RNA在制备抑制胶质瘤增殖的药物中的应用。本专利技术设计对胶质瘤增殖关联的MCM7基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型(U373细胞模型)研究其对抗胶质瘤增殖的抑制作用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新药物分子。经实验验证，转染MCM7RNA干扰组中的肿瘤生长受到抑制，该实验结果表明，本专利技术的小分子干扰RNA能下调胶质瘤中的MCM7基因表达，能够明显抑制胶质瘤的生长。附图说明图1是本专利技术实施例1中shRNA的寡核苷酸序列和PMT98质粒的连接示意图。图2是本专利技术实施例1中MCM7RNAi对脑胶质瘤细胞中MCM7的干扰作用示意图，其中，blank表示空细胞组，emptyvector表示转染空载体组；MCM7RNAi表示转染MCM7RNA干扰组。图3是本专利技术实施例1中MCM7RNAi对脑胶质瘤细胞增殖的影响示意图，其中，blank表示空细胞组，emptyvector表示转染空载体组；MCM7RNAi表示转染MCM7RNA干扰组。图4是本专利技术实施例2中三个小分子RNA对脑胶质瘤细胞中MCM7的干扰作用对比示意图，其中，blank表示空细胞组，emptyvector表示转染空载体组。具体实施方式以下实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子RNA，其对应的序列为：正义链:5′‑CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCG‑3′，如SEQ ID NO.1所示；反义链:5′‑GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCT‑3′，如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种用于抑制胶质瘤增殖的干扰MCM7基因的小分子shRNA，其对应的序列为：正义链:5′-CTAGAGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCG-3′，如SEQIDNO.1所示；反义链:5′-GATCCGCATTGATGAGTTCGACAAGACTCGAGTCTTGTCGAACTCATCAATGCT-3′，如SEQIDNO.2所示。2.一种根据权利要求1所述的干扰MCM7基因的小分子shRNA的制备方法，其特征在于，该方法的具体步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞磊，吴小江，祁伟，楼小燕，吴雪松，
申请(专利权)人：上海生博生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31