一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防治烟草青枯病的放线菌菌株及其应用方法，属于微生物技术领域。所述的菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC NO.8949。该菌株通过产生活性物质抑制烟草青枯病菌的生长，对烟草青枯病表现出较好的防治效果。所述的生防放线菌菌株用于制备生防菌剂，应用时可以在烟苗移栽时随定根水使用；或者移栽4-5天后灌根使用。该菌剂也可与有机肥混合制成菌肥使用。所述菌株K4是从烟田根围土壤中获得，与土壤生态和谐相容，因此在烟草青枯病的生物防治中具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用
本专利技术属于微生物
，涉及一种防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用。
技术介绍
烟草青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstoniasolanacearum)侵染引起的一种在世界范围内广泛传播的土传病害。该病菌株系复杂、寄主范围广、极易爆发流行，防治难度较大。烟草青枯病在我国长江流域及其以南地区普遍发生，尤以福建、广东、湖南、贵州等烟区危害较重，重病田块发病率高达90%以上，严重影响烟草的产量和品质，造成重大的经济损失。目前，在生产中主要通过栽培抗病品种、改善耕作制度和采用化学防治等措施来防治烟草青枯病。但培育抗病品种周期长，且易受环境影响，防治效果不理想。改善耕作制度，采用轮作是目前对抗该病的有效措施，但是在实际生产中很难实现。化学药剂虽在一定程度上可减轻该病的危害，但是防治效果不高，且长期使用化学农药带来的环境污染、农药残留、病菌抗药性不断增强等问题日益突出。因此寻找一种有效、安全的防治措施是当务之急。生物防治具有无毒、无残留、可利用资源丰富等优点，已成为解决土传病害的有效途径。其中，利用拮抗微生物防治植物病害已成为生物防治中的重要方向。迄今为止，筛选出的生防菌主要有假单胞菌、芽孢杆菌、菌根真菌及少数放线菌。但总体来说，我国利用拮抗菌株防治烟草青枯病的研究基础还相对薄弱，特别是高效菌种明显匮乏。放线菌（Actinomycetes）是一类具有重要经济价值和实用价值的微生物，种类丰富，广泛分布于自然界中。目前从微生物中发现的约8000种生物活性物质当中，近70%是由放线菌产生，特别是链霉菌产生的抗生素在农业生产中应用广泛，如中生菌素、阿维菌素等。土壤拮抗放线菌具有对环境友好、效果持久、针对性强等优点，展现出良好的应用前景。因此从烟田根围土壤分离获得对烟草青枯病菌具有拮抗作用的放线菌，对该病害的防治具有重要意义，符合农业的可持续发展要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：针对烟草青枯病病发生面积逐年扩大，化学防治效果不理想，同时带来环境污染的实际情况，提供一种高效防治烟草青枯病的生防放线菌菌株及其应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种生防放线菌菌株，所述的菌株为链霉菌（Streptomycessp.）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCCNO.8949。本专利技术还提供了所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。所述生防菌剂的制备方法如下：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的链霉菌（Streptomycessp.）K4接种于高氏一号液体培养基中，28℃，180r/min，培养2-3d后，制成种子液，接种于发酵培养基中；发酵培养基的配方为：淀粉2%、葡萄糖1.5%、黄豆粉2%、NaCl0.3%、CaCO30.2%，发酵条件为：接种量10%v/v、装瓶量60mL/250mL、发酵培养基初始pH值8.0、28℃，180-200r/min，培养5-6d，制成浓度为108CFU/ml的K4菌株发酵液，作为生防菌剂。以及，所述的生防放线菌菌株在烟草青枯病生物防治中的应用。具体应用为：所述生防菌剂在烟苗移栽时随定根水使用；或者在烟苗移栽4-5天后灌根使用；或者与有机肥混合制成菌肥使用。灌根使用时，每株50ml，连续使用2-3次，每次间隔8-12天。本专利技术的有益效果：本专利技术筛选出的生防放线菌K4能够明显抑制烟草青枯病菌的生长。由于是生物制剂，因此没有化学农药的使用带来的一系列问题，对减少农业污染具有重要的作用，而且有利于烟叶的绿色生产。本专利技术菌株分离自烟草根围土壤，与土壤生态和谐相容，有利于充分发挥菌株的优势。盆栽试验结果显示，该生防菌对烟草青枯病的防治效果显著，高达82.91%。同时，该菌株培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。附图说明图1为菌株K4气生菌丝和孢子丝形态（光学显微镜下40×）。图2为菌株K4孢子形态（电子显微镜7000×）。图3为菌株K4依据16SrDNA序列构建的系统发育树。图4为菌株K4发酵液对烟草青枯病菌的平板抑菌效果图。其中，1为优化之前的抑菌效果，2和3为优化之后的抑菌效果。图5为菌株K4对烟草青枯病的温室盆栽控病作用。其中，左边为施用K4发酵液，右边为清水对照。具体实施方式为了更好的理解本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术做进一步阐述，但并不是对本专利技术的限制。下述实施例中所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。一株生防放线菌，菌种命名为K4，分类命名：链霉菌（Streptomycessp.），其保藏编号：CGMCCNo.8949，保藏日期：2014年3月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。实施例一拮抗放线菌的筛选具体过程如下：1、土壤样品的采集从福建省政和县采集不同烟田地块5-20cm深处的根围土壤，共4份，分装标记后带回实验室，待自然风干后分离。2、放线菌的分离采用平板稀释法进行分离。称取土壤样品10g，倒入装有小玻璃珠和90ml无菌水的三角瓶中，震荡30min后静置5分钟，依次稀释10倍，分别配制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的悬浮液，吸取不同浓度的悬浮液各0.1ml加到高氏一号培养基（加入终浓度为50mg/L的K2GrO7）平板上，均匀涂布后置于28℃培养观察，5-7天后挑取不同的单菌落划线纯化。将纯化后的菌株转接到高氏一号斜面培养基上培养，4℃保存备用，共分离得到126株放线菌。3、拮抗放线菌的筛选采用琼脂块法对分离得到的放线菌进行抑菌活性的初筛。将放线菌接种于高氏一号培养基上培养5d后，用灭过菌的直径6mm的打孔器打出若干菌饼，挑取一块放入PDA平板中央，于28℃培养4d后，倒入含烟草青枯病菌(108CFU/ml)的NA培养基10mL，待凝固后置于28℃，2d后记录抑菌圈的大小和有无，重复3次。经初筛发现有15株放线菌对烟草青枯病菌具有不同程度的抑制作用（表1），其中菌株P10、P12、K2、K4、K13和K24对烟草青枯病菌的抑菌圈直径都在30mm以上。表115株放线菌对烟草青枯病菌的抑制作用注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P<0.05）实施例二发酵液抑菌活性的测定采用杯碟法对初筛得到的抑菌圈直径都在30mm以上的6株放线菌进行复筛。将菌株接种于种子培养基中，28℃摇瓶发酵2d后，以5%的接种量接入发酵培养基中，28℃、200r/min培养6d，发酵液于8000r/min离心5min，细菌过滤器过滤后得到无菌发酵液。在混好烟草青枯病菌(108CFU/ml)的NA平板中央打孔，孔内加入100μl无菌发酵液，28℃培养2d后测量抑菌圈直径，重复3次。结果显示（表2），菌株P12和K4的抑菌圈都在20mm以上，其中K4发酵液的抑菌效果最强，抑菌圈直径达到25mm。通过以上两步筛选确定菌株K4的抑菌活性最强且效果稳定。表26株放线菌发酵液对烟草青枯病菌的抑制作用注：同列不同小写字母表示数值间差异显著（P<0.05）实施例三菌株K4的鉴定1、形态特征观察将菌株K4划线接种在高氏一号培养基上，以45度角斜插入无菌盖玻片，2本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌（Streptomyces sp.）K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCC NO. 8949。

【技术特征摘要】
1.一种生防放线菌菌株，其特征在于，所述的菌株为链霉菌(Streptomycessp.)K4，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年3月24日，保藏号为CGMCCNO.8949。2.如权利要求1所述的生防放线菌菌株在制备生防菌剂中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述生防菌剂的制备方法如下：将所述的链霉菌(Streptomycessp.)K4接种于高氏一号液体培养基中，28℃，180r/min，培养2-3d后，制成种子液，接种于发酵培养基中；发...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢世勇，丁雪玲，谢廷鑫，陈志厚，林勇，黄建成，陈庆河，李本金，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35